| 单词 | 柞蚕核型多角体病毒载体表达系统基因工程 |
| 释义 | 【柞蚕核型多角体病毒载体表达系统基因工程】 柞蚕(Antheraea pernyi)是一种野外饲养的经济昆虫，为我国特产，其资源丰富，产量稳定。柞蚕以蛹滞育越冬，自然状态下，蛹期可达半年，人工控制可达一年。柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)是柞蚕核型多角体病的病原体，属杆状病毒科A亚组，病毒基因组为单一双链环状DNA分子，约130kb。ApNPV的宿主范围比较窄，迄今为止，只发现其与天蚕和蓖麻蚕NPV有交叉感染，对人、畜、禽等安全无害。 建立柞蚕NPV载体表达系统，以柞蚕蛹活体为宿主，高效表达外源基因产物，对促进基因工程产业化以及提高柞蚕业的经济和社会效益都具有重要意义。自1983年美国昆虫病毒学家史密斯(G．E．Smith)等建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)载体表达系统以来，有关昆虫杆状病毒载体表达系统方面的研究和应用，在基因工程的实验中日益受到人们的重视，这是因为杆状病毒载体所用的核多角体蛋白基因启动子效率高；外源基因插入容量大；重组病毒对人、畜等安全无害；并具有所表达的外源蛋白的抗原性，免疫源性和生物学功能等均与其天然蛋白相似等特点。近几年来，一系列高效表达载体相继建立，大量来自不同物种的基因在该载体系统中得到高效表达。由于AcNPV载体表达系统的宿主为昆虫细胞(SF9．H5等)，在目前条件下大量培养昆虫细胞造价高，技术复杂，设备要求严格，实际应用较困难。1985年，日本科学家前田进(S．Meada)等建立了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)载体表达系统，利用幼虫活体为宿主表达外源基因，虽然表达量高，成本降低，但幼虫需人工饲养，若大量生产，在技术操作上仍有很多不便。为了解决上述这些问题，科学家们进行了大量的研究和探索，其中方法之一就是寻找和建立理想的以活体昆虫为宿主的昆虫杆状病毒载体表达系统。由于柞蚕的蛹期长，且蛹个体大，易保存管理，更无需饲养，适合工厂化生产需要，而且其茧皮仍可被加工利用，因此，利用柞蚕蛹活体为宿主建立柞蚕NPV载体表达系统是较为理想的。建立柞蚕NPV载体表达系统，主要工作分为两大部分：一是建立ApNPV转移载体，二是将外源基因克隆到所组建的载体中，与野生ApNPV DNA一起转染宿主细胞，在细胞内经杂交重组形成载有外源基因的重组病毒。与AcNPV和BmNPV相比，ApNPV病毒有关分子生物学方面的研究报导较少。1982年，张春发等从辽宁地区典型的患柞蚕核多角体病的病蚕体内分离纯化ApNPV-DNA，并进行了限制性内切酶酶谱分析，将抽提的ApNPV DNA体壁注射柞蚕蛹，柞蚕蛹不被感染。1987年，胡裕文等以黄杉毒蛾NPV(OpNPV)核多角体蛋白基因DNA片段为探针，克隆了载有ApNPV核多角体蛋白基因的DNA片段，并进行了酶谱分析。1990年，张春发等采用人工合成寡核苷酸引物引导的点突变方法，将ApNPV核多角体蛋白基因起始密码ATG突变为ATT。去掉了其起始密码，组建了ApNPV转移表达载体质粒，但将外源基因克隆到该载体后，其重组质粒DNA与野生ApNPV-DNA一起转染柞蚕卵巢原代细胞，一直未获成功，而对照AcNPV野生DNA转染SF9细胞则能形成病毒。1992年，ApNPV载体表达系统的研究，取得了较大进展，张春发等对ApNPV核多角体蛋白基因全编码序列及其5’端和3’端侧翼部分非编码序列(1075bp)进行了核苷酸序列分析，结果表明，ApNPV核多角体蛋白由735个核苷酸序列编码，245个氨基酸组成，其核苷酸序列与AcNPV和BmNPV相比差异显著，特别是控制该基因表达的5’端启动子调控序列(nt－2－61)部分：AcNPV与BmNPV完全相同，而ApNPV在此区域却有20个核苷酸序列发生变异，在其对基因表达起决定性作用的8个高保守核苷酸序列TAAGTATT(nt－44－51)中就有两个不同。采用引物延伸(Primer extension)法，测定ApNPV核多角体蛋白基因mRNA转录起始点位于nt－50位点，与AcNPV相似。在此基础上，张春发等采用寡核苷酸引物引导的点突变和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简写PCR)方法，分别组建了pApM741．748．736和740转移表达载体，其外源基因克隆位点分别为nt－+1，+8，+35和+140(均为BamHl切点)。为了验证上述所组建的系列载体的表达功能，根据ApNPV核多角体蛋白基因与AcNPV核多角体蛋白基因核苷酸序列同源性较高的特点，分别将人白细胞介素4等外源基因克隆到所组建的4个载体中，将其重组质粒DNA与AcNPV野生DNA一起转染SF9细胞，经免疫荧光检测，供试4个载体所载外源基因均得到表达。将pApM741和748载体所载的外源基因重组质粒DNA与柞蚕NPV野生DNA一起转染柞蚕卵巢原代细胞和直接转染柞蚕蛹均获得成功，用PCR法对从被转染的柞蚕卵巢原代细胞和柞蚕蛹病毒液中抽提的ApNPV-DNA进行检测，经序列分析证实，所表达的外源基因已整合到ApNPV基因组中。将转染发病的蚕蛹病毒液10倍稀释成10－2，10－4和10－6等不同浓度，并分别接种柞蚕蛹，数天后，蚕蛹均发病；取蚕蛹病毒液，用免疫沉淀及同位素标记等方法对所表达的蛋白进行分析检测，同时，以AcNPV载体表达系统表达的该外源蛋白做对照，实验证实，外源基因确以非融合蛋白形式被表达，其表达量(V／V)初步估计将高于AcNPV载体表达系统25倍以上，从而组建了柞蚕NPV载体表达系统。本载体表达系统的组建，在设计上采用点突变的方法将ApNPV核多角体蛋白基因的起始密码去掉，从而保留了起始密码(ATG)前对mRNA转录有显著影响的5’末端基因调控序列及起始密码后对外源基因表达翻译有重要作用的部分编码序列。但究竟保留ATG后多长编码序列，对外源基因高效表达效果最佳，至今尚无定论，值得进一步探索。从对柞蚕NPV核多角体蛋白编码基因及其5’末端和3’末端部分侧翼核苷酸序列分析的结果来看，虽然其编码基因序列与AcNPV和BmNPV有较高的同源性，但值得注意的是其核多角体蛋白基因启动子调控序列(nt61)却与AcNPV和BmNPV有显著差异，而后二者除了BmNPV在－1位点比AcNPV少一个核苷酸外，其它完全相同。通常，在启动子调控序列区域，特别是在mRNA转录起始点前后序列，任何一个核苷酸的变异或缺失都可能对外源基因表达水平产生显著影响。以此来看，ApNPV核多角体蛋白基因启动子部分核苷酸序列有近1／3发生替换，其是否与ApNPV核多角体蛋白基因的启动子表达强度有关，进而哪些核苷酸的变异对表达影响最大，这无论在基因表达机制和实际应用研究方面都将是十分有意义的课题。柞蚕NPV载体表达系统建立以后，人们的注意力将集中在该载体表达系统的实际应用上。从这一角度讲，还有很多研究课题需要进一步深入开展。例如，建立柞蚕NPV敏感细胞系，为采用空斑方法纯化重组病毒提供宿主细胞。这项工作难度较大，国内已有几个实验室在开展此项研究工作，但到目前为止，还未有突破性进展。此外，利用柞蚕蛹为活体表达宿主，在外源蛋白的分离纯化上将与用昆虫细胞为宿主情况不同，需针对性的探索建立一套相应的分离纯化方法。ApNPV载体表达系统的建立，为昆虫杆状病毒载体提供了以柞蚕蛹为活体表达宿主的新成员，相信它将为促进昆虫杆状病毒载体表达系统的实际应用直到积极作用，同时也将为综合利用我国独特的柞蚕资源开辟一新的途径。【参考文献】：1 Luckow V A，Summers M D．Trends in the development of baculovirus expression vectors．Biotechnology，1988，6：47～552 Rankin C，Ooi B G，Miller L K．Eight base pairs encompassing the transcriptional start point are the major determinant for baculovirus polyhedrin gene expression．Gene．1988，70：39～493 刘淑珊，何龙．柞蚕蛹卵巢细胞原代培养及对柞蚕核型多角体病毒的敏感性，蚕业科学，1988，14(4)：224～2254 张春发，范琦，刘淑珊，李文利，王林美，李广泽．柞蚕NPV核型多角体蛋白基因核苷酸序列分析及其mRNA转录起始点的确定；蚕业科学．1992，18(2)5 张春发，刘淑珊，范琦，等．柞蚕核型多角体病毒转移载体的组建及所载外源基因在SF9细胞，柞蚕卵巢原代细胞和柞蚕蛹活体宿主中的表达．蚕业科学，1992，18(3)：(张春发撰) |
| 随便看 |
科学参考收录了7804条科技类词条，基本涵盖了常见科技类参考文献及英语词汇的翻译，是科学学习和研究的有利工具。