【细胞色素P450单加氧酶及其化学模拟】
拼译：cytochrome P450 monooxygenase and their chemical models
单加氧酶是一类重要的金属酶，它通过两个电子和两个质子的参与，催化分子氧活化，分子氧的一个氧原子插入底物使底物发生加氧反应，另一个氧原子与质子结合成水：
RH+O2+2e－十2H+→ROH+H2O
细胞色素P450(Cyto P450)是一种特殊的血红素蛋白，是普遍存在的一组单加氧酶，因其还原型与CO结合会使420nm的Soret谱带分裂为364和450nm的谱带而得名。Cyto P450是由克林真伯格(M．Klingenberg)首先发现(1958)，并经木村(T．Omura)和佐藤(R．Sato)验证和命名(1964)的一类b族细胞色素。它广泛存在于各种哺乳动物组织、昆虫、植物、酵母和细菌中，人体中以肝、肾、肺、脑、鼻膜和肠粘液等组织中浓度最高。有关Cyto P450的生物化学、药理学和毒理学研究表明，Cyto P450在类固醇、脂肪酸和前列腺素等内源化合物的生物合成和生物降解的多种步骤以及药物、杀虫剂和化学致癌物等外源化合物的氧化代谢过程中起着极其重要的作用。它以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为电子给体，催化分子氧对戊巴比妥、苯巴比妥等脂肪烃和芳香烃羟基化、氯甲桥萘等烯烃环氧化和含杂原子底物N脱烷基化(如美舍东，methadone)、O－脱烷基化(如甲基吗啡碱)、氧化脱氨基化(如冬眠灵)、S－氧化(如氯丙嗪)及还原脱卤化(如氟烷)。与Cyto P450在生物合成、代谢和解毒中的有益作用相反，某些药物的毒性作用及化学致癌也与Cyto P450有关。已经对来源不同的Cyto P450结构进行了大量研究，其中来自兔肝的P450LM2和假单胞菌(Pseudomonas Putide)的茨酮羟化酶(P450cam)研究得最多。1985年普罗斯(J．T．Poulos)成功地测定了P450cam静态和底物结合态的晶体结构。P450cam的分子量为45000，414个氨基酸组成的多肽链形成一个近似于最大尺寸为60×10－10m、最小尺寸为30×10－10m的三棱柱，其中12条螺旋链段占结构的44%，而反平行的β折叠仅占10%。P450cam的血红素(铁原卟啉
)夹在两条平行的螺旋链段间。由于肽链上半胱氨酸(Cys 357)的巯基硫在轴向配位，血红素的铁原子呈五配位状态。底物2－茨酮与P450cam结合时，是深入到位于血红素之上的袋囊，并紧接着O2在血红素的键合位置的。除了与邻近的疏水性脂族和芳香族残基保持接触，2－茨酮还通过其羰基氧与酪氨酸(Tyr 96)的羟基之间形成的氢链而稳定在袋囊中。已经证明，来源不同的P450都有类似的组成和结构。血红素作为Cyto P450的活性中心在底物加氧反应中起着极其重要的作用，70年代末80年代初，以金属卟啉配合物作为模拟主体的Cyto P450单加氧酶化学模拟研究引起了化学家的极大兴趣。测定包括氧活化和底物羟化整个催化过程中作为中间体的铁配合物的性质，尽可能弄清Cyto P450在催化过程的作用机理，是Cyto P450化学模拟研究的一个重要方面。在大量研究的基础上，1987年曼苏伊(D．Mansuy)描述了一种较为人们所接受的Cyto P450催化循环机理：(1)静态的Cyto P450存在着5配位的高自旋Fe(Ⅲ)卟啉配合物(第6配位位置空着)与六配位的低自旋Fe(Ⅲ)卟啉配合物(第6配位位置可能是含OH的分子)的平衡，当底物结合到蛋白链的疏水部位时，平衡移向高自旋态；(2)NADPH的一个电子转移到铁卟啉上，使Fe(Ⅲ)还原为Fe(Ⅱ)：(3)分子氧结合到Fe(Ⅱ)卟啉的第6配位位置，形成六配位的低自旋态稳定中间体；(4)伴随着第2个电子离开NADPH转移到以上中间体，OO键断裂，生成不稳定的活性氧合中间体［Fe(V)=O］和水；(5)［Fe(V)=0］的氧向底物转移，使底物发生加氧反应，氧化型的Cyto P450再次生成，使循环闭合。Cyto P450催化循环中所形成的活性氧合中间体［F(V)=O］的结构仍未确定，因为它寿命很短，难以进行直接的光谱测定。其它中间体的铁卟啉摸拟化合物都已制备及表征。在应用铁卟啉模拟体系研究某些外源化合物的代谢过程时，有关含FeN键、Fe－C键的底物与铁卟啉形成的稳定中间体的直接分离和表征，已有不少报道。石油化工生产中，由烷烃和烯烃制取醇和环氧化物，需要高温高压等苛刻工艺条件，建立能再现Cyto P450所催化的主要反应的模拟体系，探索在工业生产中实现温和条件下烃类氧化的可能性，成为Cyto P450化学模拟研究中最活跃、最具挑战性的课题。人们对于作为潜在的氧化剂及酶模型的金属卟啉进行了大量研究工作。Cyto P450模拟体系通常包括：作为催化剂的金属卟啉配合物和轴向配体；给电子的还原剂；氧源和底物。目前所报道的模拟体系，使用的氧源包括：分子氧、亚碘酰苯、过氧化氢或有机过氧化物、次氯酸钠、氨氮氧化物(N－氧化物)和过硫酸氢钾等，尤以分子氧、亚碘酰苯和过氧化氢居多。1979年田伏(I．Tabushi)报道了以锰卟啉为催化剂、硼氢化物为还原剂、分子氧为氧源的Cyto P450模拟体系，实现了环己烯的催化氧化。已报道的以分子氧为氧源的模拟体系，还有以抗坏血酸、胶态铂、锌粉和H2等为还原剂的。一般说来，这些体系都重现了Cyto P450的主要反应，但催化活性都较低，相对于还原剂的产率，烯烃环氧化为0．1%～5%，烷烃羟化为0．01%～D．5%。普遍认为，这是由于底物与过量的还原剂之间存在着对活性的金属卟啉氧合中间体的竞争，还原剂还原氧合中间体的反应比底物与氧合中间体的反应快得多的缘故。加入咪唑作为金属卟啉的轴向配体，大大提高了体系的催化活性。据报道，以水溶性锰卟啉和N－甲基咪唑为催化剂、二羟基吡啶为还原剂、黄素单核苷酸为电子转移催化剂的模拟体系催化橙花醇环氧化，相对于还原剂的产率达到30%。以往的大量研究结果表明，以分子氧为氧源的模拟体系，苯环上带推电子取代基的四苯基卟啉衍生物的金属配合物催化活性较高。但1990年埃利斯(P．E．Ellis)发现，带五氟代苯基的四苯基卟啉衍生物的铁配合物有较高的催化活性和催化选择性，丙烷和异丁烷的羟化产率达18%(相对于底物)。以单氧给体亚碘酰苯为氧源的Cyto P450模拟研究十分活跃。1979年格罗夫斯(J．T．Groves)首先采用四苯基卟啉的铁配合物和亚碘酰苯组成模拟体系，实现了温和条件下烷烃的羟化和烯烃的环氧化。类似的体系已有许多报道。在这些体系中，不但再现了Cyto P450催化烯烃氧化时存在的如双键的立体选择性环氧化、烷烃C－H键的羟化、RCH=CH2部份成醛RCH2CHO及N－烷基化卟啉的形成等反应，而且还发现了芳香烃羟化过程中羟化部位的氢原子向其邻位的转移(NIH转移)。研究表明，铁卟啉和锰卟啉催化效果较佳。但简单的四芳基卟啉金属配合物在催化过程中容易降解，对烷烃等反应性较差的底物催化时更为严重。已经发现，在四芳基卟啉的芳基上引入卤原子，可使体系的催化活性和催化剂的稳定性得到改善。其中以特蕾勒(T．G．Traylor)报道的用四－(2，6－二氯苯基)卟啉铁配合物Fe(TDCPP)Cl和四－(2、6－二氯苯基)八溴卟啉铁配合物Fe(TDCPOBP)Cl作为催化剂的体系对烯烃和烷烃的催化比较成功。以过氧化氢为氧源的模拟体系，只有在体系中加入一定量的咪唑才能有效地催化烯烃环氧化或烷烃羟化。据认为，除了作为轴向配体，咪唑还起着一种酸碱催化剂的作用，它的存在有利于过氧化氢的去质子化和水分子的脱离。已有报道，以过量2～6倍过氧化氢的H2O2－Mn(TDCPP)Cl－咪唑体系催化烷烃羟化，室温下2h内50%～80%烷烃已转化为相应的醇和酮。Cyto P450的化学模拟研究，在阐明Cyto P450单加氧酶的反应机理方面已经取得了重大进展，但是，对于Cyto P450催化循环中分子氧的活化和氧向底物的转移这两个关键仍然认识不多。从分子水平上对分子氧的活化和氧向底物的转移过程的研究，将是今后研究的重点之一。尽管近20年来在寻找可应用于有机合成化学的Cyto P450模拟体系方面作了大量的研究工作，并取得了许多有意义的结果，但是在分子水平上模拟Cyto P450单加氧酶，尤其是直接以分子氧为氧源的研究仍远远落后于应用方面的要求。对Cyto P450的活性部位进行模拟，通过对卟啉环进行化学修饰，合成更接近天然酶的卟啉配体；寻找和设计对底物的加氧具有高效、高选择性的模拟体系，仍然是Cyto P450化学模拟研究的一个重要方面。天然酶的蛋白质环境对酶的作用是至关重要的，对天然酶的微环境进行化学模拟是值得重视的研究课题。近年来开展的将金属卟啉接到可溶性高分子材料，或直接在有机、无机高分子载体上合成金属卟啉的研究工作，对于改善催化剂的催化活性和稳定性都有重要意义。总之，Cyto P450的化学模拟研究方兴未艾，可以相信，随着对Cyto P450及其化学模拟体系研究的不断深入，人们最终将实现温和条件下烃类的选择性氧化。【参考文献】：1 Omura T,et al.J Biol Chem, 1964,239:23702 Groves J T,et al.J Am Chem Soc, 1979,101:10323 Tabushi Let al.J Am Chem Soc, 1979,101:64564 Roulos J T,et al.J Biol Chem, 1985,260:161225 Mansuy D. Pure Appl Chem, 1987,59:7596 Mansuy D. Eur. J Biochem, 1989,184 : 2677 Ellis P E,et al. Coord Chem Rev, 1990,105:1818 Gunter M J,et al. Coord Chem Rev, 1991,108:1159 计亮年，等．化工进展，1991，3∶9(中山大学黄锦汪副教授撰；计亮年审)