【淋巴细胞亚群的分离及其功能测定】
拼译：separation and determination of lymphocyte subsets
淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，是不均一的群体，各亚群具有不同的功能。随着科学技术的发展，利用淋巴细胞表面抗原的不同可以分离各种淋巴细胞亚群，从而进一步研究其功能及其相互调节作用，可分析各种疾病时何群细胞存在缺陷及免疫失调，为免疫生物学和医学的研究揭开新的一页。依靠T细胞表面标志分离高纯度的T细胞亚群，并由于杂交瘤技术的迅速发展导致越来越多的抗人白细胞分化抗原的单克隆抗体(McAb)，这些抗体包括抗各亚群T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、K细胞等McAb。
1982年11月巴黎会议上第1届白细胞分化抗原研究小组报告了对189种McAb的鉴定结果，分析各种McAb反应性间的差距，鉴别出对各种靶细胞抗原有相似的或不同反应性的抗体群，属于十分相似的细胞反应和分子量的即归于同一分化群，并统一使用分化群作为抗原的命名。人体周围血淋巴细胞主要含有T、B淋巴细胞。T淋巴细胞主要分成两大亚群，一类表现有CD4表面抗原，即T辅助细胞(Th)或诱导细胞亚群(Ti)；另一类表现有CD8表面抗原，即T抑制细胞(Ts)或细胞毒性细胞(Tc)，T细胞参与细胞免疫反应，B细胞参与体液免疫反应，二者相互联系和制约。分离淋巴细胞亚群的方法(1)外周血单个核细胞制备：肝素抗凝静脉血加至淋巴细胞分离液上，离心2000rpm，20min，然后吸取两液交界面的白色细胞层即得。(2)分离T、B淋巴细胞：2×107淋巴细胞加lml4%绵羊红细胞混匀，形成玫瑰花反应，T细胞比重大则下沉，上层液中为B淋巴细胞。用氯化胺缓冲液溶去T细胞外连的羊红血细胞即为T淋巴细胞。(3)花环法：T细胞用CD4McAb包被，然后和山羊抗鼠IgG包被牛红细胞形成玫瑰花，即为CD4细胞，非玫瑰花细胞即为CD8细胞。相反，T细胞用CD8McAb包被，再和山羊抗鼠IgG包被牛红细胞，产生CD8细胞的玫瑰花结，非玫瑰花细胞即为CD4细胞。(4)铺皿法(Panning)：根据1988年杨(C．Young)报道的方法，将亲和纯化的羊抗鼠lgG加入到塑料平皿中，再加入5ml0．05mol／L的Tris－HCl(H+浓度5×10－10mol／L)缓冲液混匀。4℃过夜，次日吸去上清液，用0．01mol／L的PBS(H+浓度6．31×10－8mol／L)洗3次，再用含1%小牛血清和0．01mol／L的PBS5ml室温下作用15min，然后再用0．01mol／L的PBS洗3次，备用。将106个淋巴细胞加入100μl McAbCD4或McAbCD8，4℃作用30～45min，然后用Hanks’液洗3次，最后用培养基悬浮细胞，加入到上述的包被二抗的塑料平皿中，每皿加入总量3ml含细胞107个，于室温中1h，15min轻摇1次，吸去非粘附细胞，粘附细胞加入Hanks’液用力吹打，洗脱下来的即为所需的CD4或CD8细胞，再用Hanks’液洗3次。(5)亲和层析法：羊抗鼠IgG和溴化氰活化的Sepharose 4B结合后装柱，柱床体积为2．5ml，用0．01mol、H+浓度6．31×10－8mol／L。PBS平衡柱体，继用0．1mol硼酸缓冲液和RPMI1640液(抗生素浓度加倍)进行柱无菌处理，再用RPMI1640液平衡柱体。将CD4，McAb标记好的淋巴细胞置层析柱上，待细胞悬液进入柱体后，再加0．2ml RPMI1640液，4℃孵育20min，用40ml 1640液冲洗柱体，收集洗脱液，离心沉淀得到去除了CD4亚群的淋巴细胞。随后柱顶加入1ml含100μg羊抗鼠IgG的PBS，4℃放置30min后再用40ml冷PBS含10μg／ml羊抗鼠IgG冲洗柱体，收集洗脱液，离心沉淀即可得到CD4细胞。若用CD8McAb标记淋巴细胞过柱，首先洗脱的为非CD8细胞，随后再用羊抗鼠IgG的PBS洗脱下来即为CD8细胞。(6)补体介导杀伤技术(细胞溶解)：T细胞首先培养于CD8McAb的培养液中100μl／106细胞，37℃ 20min后，细胞离心300×g，吸去含游离抗体的上清液。淋巴细胞沉淀物复溶于10%兔补体的溶液中，37℃培养1h，离心300×g10min，吸去上清液，沉淀复溶于新鲜兔补体同上，培养1h后吸去兔补体，留下的为CD4细胞，用25ml RPMI1640液洗4次。若用CD4McAb和兔补体溶解CD4细胞则可获得CD8细胞。常用的淋巴细胞亚群的功能测定方法(1)镜检法：肝素抗凝血滴入培养液中，内含各种丝裂原PHA、ConA、PWM和LPS，分别激活不同的淋巴细胞群体，导致细胞转化，利用显微镜观察转化细胞及母细胞数占总淋巴细胞数的百分率。本法需用的仪器较简单，过去曾被广泛应用，但观察结果有主观误差，现已很少应用。(2)放射性同位素标记化合物掺入法：肝素抗凝血0．2ml滴入RPMI1640培养液2ml中，每毫升分别含丝裂原PHA100μg／ml、ConA10～30μg／ml、PWM5～10μg／ml或LPS20μg／ml，37℃孵育56h后加入标记化合物3H－TdR0．6－luCi、14CUR0．3μCi，3H－酪氨酸2uCi或14C－缬氨酸1uCi，以分别反映各群淋巴细胞转化过程中DNA，RNA或蛋白质合成能力。继续培养16h，培养结束时每个样品加入蒸馏水6ml，滴于具有抽滤装置的49型玻璃纤维膜上过滤，按序以生理盐水5ml洗涤，5%三氯醋酸5ml固定，无水乙醇3ml漂白、干燥。滤膜烘干，置二甲苯闪烁液(含PP00．4%，POPOP0．04%)5ml中，用液体闪烁计数器测定每分放射性计数值(CPM)，除按0．2ml血计算CPM外，还根据血样中淋巴细胞绝对值换算成每2×105淋巴细胞的CPM。后者反映掺入更准确。每份标本同时设2～3个平行样品，数据取平均值。PHA·ConA·PWM激活淋巴细胞在国内外已被广泛应用。但是一般认为LPS只对动物(小鼠)脾脏的B淋巴细胞产生激活作用。1975年林(N·R·Ling)认为LPS对人血B淋巴细胞不起作用。苏燎原应用上述掺入法成功地用它激活人血B淋巴细胞，并测定了结核病、麻风、肾炎、肿瘤等病人加以验证，能反映体液免疫的动态变化。用上述方法分离的淋巴细胞亚群均可用单独或混合培养，接受各种丝裂原激活后掺入法可以反映各群细胞的功能及互相协同作用，体现免疫调节。(3)细胞集落法：淋巴细胞分别用含丝裂原的培养液制成单细胞悬液，加至含0．3%琼脂适合人血淋巴细胞增殖的培养基中，每皿接种5×104个细胞／0．2ml，放入密封的含饱和湿度和一定浓度的CO2的容器中，37℃培养7d收获计数，生长的集落形态好，轮廓清楚，50个细胞以上计为1个集落。(4)自然杀伤(NK)活性测定：分离的单个核细胞，应用3HTdR标记人白血病K562细胞(或其他肿瘤细胞)作为靶细胞。以效应细胞与靶细胞等于30～50∶1，作用46h，结束时用滤膜法收获细胞，液体闪烁计数器测量K562细胞经释放放射性后还存留在细胞内的放射性活度，以间接反映淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的活性。也有人应用51Cr或125I－UdR释放试验。(5)K细胞活性测定：用RPMI1640液配成2×106个／mlK562细胞悬液，注入兔静脉内连续5d，注入量分别为1、2、3、4、5ml，末次注射后1周抽血，用沉降环法确定抗血清效价为1∶3200，然后抽兔血分离血清，灭活后即为抗K562细胞的血清。K562细胞经3H－TdR标记后作为靶细胞。外周血单个核细胞与K562细胞的比例为30～50∶1。再加入抗K562细胞的血清。测定活性方法同(4)。也有人用
标记鸡红细胞作为靶细胞，加相应的抗鸡红细胞血清(用上述方法免疫制成)和待测淋巴细胞共同温育，根据51Cr释放量反映K细胞的活力。淋巴细胞及其亚群的研究是基础免疫中的一个重要课题，它为肿瘤免疫的研究开拓了一条新的途径，把这些基础研究的结果运用到临床已经有了一些探索，需要进一步深入。利用T细胞的McAb分离T淋巴细胞亚群可测定其功能及各群的相互调节作用，还可对T淋巴细胞性白血病或淋巴瘤进一步分型，一些自家免疫性疾患及衰老过程中免疫系统的不平衡状态是值得注意的问题。微观研究仍在不断深入，如CD4中有5个抗体，它们可能是识别同一大分子上的不同抗原决定簇的抗体，说明在CD4细胞中还存在更小的亚群，有些抗体呈现交叉反应，以上问题有待探索。【参考文献】：1 汤美华，等．介绍人白细胞分化抗原的国际命名法，国外医学输血及血液学分册，1987，10(4)：231～2352 白炎．抗人T淋巴细胞表面分化抗原的单克降抗体，中华病理学杂志，1983，12(4)：305～3083 洪锦心．人体淋巴细胞亚群研究进展．肿瘤，1984，4(1)：31～344 徐映东，等．美洲商陆丝裂原(PWM)激活淋巴细胞及
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