| 单词 | 番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因克隆与表达 |
| 释义 | 【番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因克隆与表达】 拼译：cloning and expression of CP gene of PRV 番木瓜环斑病毒病(PRV)是世界各番木瓜产区的毁灭性病害，尚无有效的防治措施。 1986年，埃布尔(P．P．Abel)等首次克隆了烟草叶病毒(TMV)外壳蛋白(CP)基因，并且利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)叶盘感染法导入烟草细胞。CP基因在烟草中稳定遗传表达，使烟草普通花叶病发病期推迟13天以上。此后短短5年，世界各地科学家针对7组20多种植物病毒克降了CP基因，其中7种已获得工程植物，它们对CP基因来源的病毒甚至异源病毒表现程度不同的抗性。PRVCP基因的克隆与表达也取得较大发展。1985年，内格尔(J．Nagel)等合成并克隆了PRV－W RNA3′区段cDNA，根据体外翻译结果及其与马铃薯Y病毒(PVY)组其他成员的研究结果比较，推断PRV CP基因于病毒RNA的3′端。1990年，奎马达(H．Quemada)等合成并克隆了PRV HA5－1 RNA的3′区段cDNA。通过分析两个株系RNA3′区段cDNA碱基序列和CP氨基酸顺序，提出CP基因序列，其长度为864碱基。1990、1992年，费奇(M．M．M．Fitch)等以未成熟胚、胚轴切段和体细胞胚为受体，用高速微弹法(基因枪法)将构建在pGA482GG的CP嵌合基因导入番木瓜。对于卡那霉素选择培养基上生3周的愈伤组织、6个月的体细胞胚进行报告基因β－葡糖苷酶基因(GUS)和新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因(NPT Ⅱ)表达的检测，得到阳性结果。由转化细胞再生的植株在温室中对PRV HA有显著抗性，对来自泰国的PRV则几乎没有抗性。1991年，凌凯树等将上述嵌合基因通过叶盘感染法转化了烟草，试验结果表明转基因烟草PRV CP表达量占叶片总蛋白的0．09%～0．25%，对烟草蚀纹病毒(TEV)、PVY、胡椒斑驳病毒(PeMV)有较强的保护作用，但对非PVY组的黄瓜花叶病毒(CMV)无效。库胡尔(A．R．Kuehule)、斯考查(R Scorza)分别测到转基建兰、李表达了PRV CP，以期进一步验证其介导的异源抗性。1991年．叶长明等根据奎马达报道的PRV CP基因序列，在人工合成的两段引物引导下，以华南PRV·Ys的RNA为模板，反转录合成了CP基因cDNA第1链，并通过聚合酶链式反应(PCR)体外扩增得到双链cDNA，然后克隆进大肠杆菌质粒载体pUC18和pUC19。序列分析表明该基因与奎马达报道的差异较大，同源率为89．3%，且少连续6碱基。Western blot检测发现CP基因能在大肠杆菌中有效表达，在此基础上将CP基因插入pRoK Ⅱ35S启动子和nos终止序列之间构建了植物表达载体pRPC，通过“三亲交配”将此载体引入农杆菌LBA4404，与其中的Ti质粒pAL4404构成双元载体系统。1991年，刘俊君等合成并克隆了PRV－Sm的CP的基因，此基因与国外报道的差异也较大，同源率为88．43%，而与PRV－Y用类似的方法构建CP基因同源率达96．1%。有人认为CP基因只能表达对其来源的那种病毒或株系的抗性，奎马达的研究结果支持这种观点。但凌凯树等观察到一种CP基因工程植株对其他类似病毒或株系也有抗病效果。这又与上述观点相矛盾。显然对转CP基因植物的抗性机理还有待于深入研究。PRV CP基因转化番木瓜工作进展较为缓慢，这主要由于番木瓜组织培养和转基因技术研究没跟上。1990～1991年叶克难等在番木瓜人工种子和外源基因导入方面获重要突破。用这些技术已获得PRV－Ys CP基因转化的番木瓜愈伤组织，拟通过体细胞胚发生途径再生植株。表达几种病毒CP转基因值物都有一定局限性，即只能抗一种或少数几种病毒，保护期还不能达到理想的长，当受到大量毒源重复接种时抗病性丧失或明显减弱。番木瓜是热带和亚热带多年生植物，传毒蚜虫周年保护较高数量，仅仅依靠CP基因难以取得理想效果，人们正着手克隆病毒核酸复制基因、抗体基因、核酶基因等可能更有希望。同时有必要将基因工程与常规育种结合起来，即在选育矮生、早熟、耐病品种的基础上引入抗病基因。由于番木瓜属于异花授粉作物，后代性状变异大．在保持品种的抗病性等优良性状方面，人工种子等无性繁殖技术将显示出特殊作用。【参考文献】：1 Nagel J, Hiebert E. Virol. 1 985..143:435～ 4412 Fitch M M M. Manshardt K M. Gonsalves D, et al. Plant Cell Rep,1990,9:189～1953 Quemada H,Hostis B L. GonsalvesD, et al. J Gen Virol, 1990,71:203～2104 Ling K S, Namba S, Gonsalves C. et al. Bio/Technology, 1991,9:752～7585 Scorza R, Cordts J M, Mante L M, et al. Hortscience,1991,26:7866 叶长明，叶寅，骆学海，等．植物病理学报，．1991，21∶1～47 叶寅，叶长明，骆学海，等．华南农业大学学报，1992，13∶6～98 Fitch M M M，Manshardt R M．Gonsalves D，et al．Bio／Technology，1992，1l∶1466～14729 Kuehule A R．Plant Cell Rep．1992．11∶484～48810 Suwenza L，Manishardc L．Horiscience，1992，27∶660(华南农业大学叶长明博士撰；范怀忠审) |
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