| 单词 | 植物种质超低温保存 |
| 释义 | 【植物种质超低温保存】 拼译：cryopreservation of planl germplasm 植物种质，包括种子、花粉、细胞、组织和器官，即亲代通过生殖细胞和体细胞传递给子代的遗传物质。植物种质超低温保存，是以液态氮为冷源，使保存温度维持在零下196℃。植物材料在如此低温下，新陈代谢活动基本停止，因此一旦冷冻程序建立，植物材料不仅可以长期保持其生命力，而且还能保持其形态发生潜力和遗传稳定性。植物细胞、组织经超低温长期保存后再生完整的植株，为植物种质资源长期保存开辟了新途径，特别是对无性繁殖作物和不能进入低温干燥种质库保存的植物花粉、顽拗型种子等的长期保存具有重要的理论价值和应用价值。 植物种质超低温保存是现代低温生物学的一个重要领域。一些学者认为，现代低温生物学是以1949年波尔吉(polge)发现甘油可以减轻鸟类精子的冷冻损伤为开端的。此后在医学和畜牧业研究较多，并取得重要进展，如人体皮肤、角膜、心脏及动物精液和胚胎的成功保存和应用。植物种质超低温保存的研究，可追述到1897年布朗(Brown)将辣子瓜、西葫芦等种子慢速冷冻到液态空气(－192℃)保存110h，发芽率没有明显变化。1908年，怀特(white)将梨、大麻、芸苔属种子快速冷冻到液态空气中，保存36h仍有发芽能力。1905年，伯坤尔(Bequere)将羽扇豆和番茄种子快速冷冻到液态空气保存130h，发芽率没有明显变化。诺尔顿(H．E．Knowlton)最早研究植物花粉的超低温保存，1922年，他将金鱼草花粉冷冻到－180℃仍获得一定程度的萌发率。1947年，布里德曼(Bredemann)等发现羽扇豆花粉在液态空气中保存3个月仍有活力。70年代以后，超低温保存植物种子和花粉的研究已有较大的进展，保存的植物种类扩大并开始走向应用。正常型种子(即能忍耐干燥低温的种子，如小麦、水稻、高粱、大麦、烟草、莴苣、车轴草、甜菜、洋葱、萝卜、番茄等，的超低温保存技术已基本建立，但是有些正常型种子保存方法尚未完全解决，如大豆、亚麻、菜豆、芝麻等。1985年，斯坦伍德(stanwood)报道已有155个植物种、455个代表植物的种子能成功地在液氮温度下保存。一些专家认为，利用液态氮不仅可以长期保存植物种质，而且费用较机械空调的低温干燥种质库低。在美国科罗拉多州科林斯堡国家种子贮存试验室(NSSL．)新建的种质库中，有一半面积用于超低温保存种子、花粉和组织培养物。从1955年到1988年已报道超低温保存花粉的植物有20多种，如黑麦、玉米、水稻、桃、李、梨、唐菖蒲、木瓜、枣椰子、马铃薯、甜菜、番茄等。巴纳巴斯(Barnabas)1976年和1981年报道，玉米花粉在－196℃保存1a仍有29．2%的授粉能力，1989年石思信报道，玉米花粉在－196℃保存1a，田间授粉结实率达73．4%。1980年奥穆拉(M．Omura)报道，在日本Yatabe果树试验站利用低温冷冻技术已保存桃的60多个栽培品种和品系的花粉，桃的花粉已保存10余a。长期保存植物花粉可为育种家随时提供有活力的花粉，克服“花期不遇”和“异地杂交”问题；花粉置于冷冻瓶中，可长途运输，有利于种质交换。在植物细胞和组织的继代培养过程中，会发生染色体和基因型的变异，可能导致培养细胞全能性丧失，即失去其形态发生潜能或者某些重要性状的丢失。超低温冷冻保存技术同组织细胞培养密切结合，为保持植物细胞组织培养物的遗传稳定性提供了理想方法。1986年，奎特拉诺(Quatranv)首次报道亚麻细胞悬浮培养物在－56℃下冷冻保存成功，到1990年通过愈伤组织和悬浮培养细胞超低温冷冻保存成功的植物达32种，如烟草、曼陀罗、胡萝卜、亚麻、水稻、人参、玉米等的悬浮培养细胞，木棉、陆地棉、杨树、甘蔗、唐菖蒲等的愈伤组织，经超低温保存不同时期，再培养成苗。植物茎尖分生组织的细胞，分化程度小，倍性一致，遗传较稳定，离体培养易再生新植株，是超低温保存植物种质的重要材料，可建立植物无病毒无性系种质库。1976年，塞伯特((M．Seibert)首次报道了麝香石竹茎尖超低温保存后再生植株，到1988年已经有13种植物的茎尖分生组织成功地进行了超低温保存，如豌豆、花生、马铃薯、草莓、番茄等。在植物组织培养中产生的胚状体数量多，繁殖快，结构完整，可人为地创造出同天然种子相似的人工种子。1976年，和1978年巴加(Y．P．S Baiaj)先后报道了胡萝卜体细胞胚状体和烟草花药胚状体超低温保存成功，获得植株，为人工种子的长期保存提供了有效途径。木本植物的枝条和冬芽的超低温保存在近十几年进展较快，日本酒井昭做了较多的研究工作，1978年他将苹果冬芽预冷到－40℃再浸入液氮2h，解冻后嫁接到2a生砧木上，多数芽正常生长。1987年，简令成将柳树冬枝冷冻到液氮温度，解冻后插条获得新植株。1988年，王利民将桑树冬芽预冷后再投入液氮中，解冻后培养成苗。枝条和芽超低温保存成功对长期保存多年生木本植物种质有重要实用价值。由于使用的材料不同，植物种质的超低温保存方法差异很大，主要程序可归纳为：材料的选择和准备，预处理，冷冻保护剂的使用，冷冻降温，保存后的解冻，生活力测定和再培养，遗传稳定性分析。材料的选择和准备：植物种质超低温保存的材料可分为两大类，一类是经过组织培养的材料如细胞悬浮培养物、愈伤组织、茎尖分生组织、胚状体等；另一类是不经组织培养的材料如种子、花粉、枝条等。材料的基因型、抗冻性和培养物的再培养年龄对冷冻保存有重要影响。一般认为静止期的和延迟早期的细胞对冷冻敏感，因这一时期的细胞体积大、液泡化程度高。处于指数生长期的和滞后期的细胞体积小，质液比高，细胞抗冻能力增强，悬浮培养细胞以再培养5～7d为宜，愈伤组织以10～15d为宜，胚状体为幼龄球形胚成活率高。夏季生长茂盛的枝条不宜超低温保存；冬季经过低温锻炼的枝条，抗寒能力增强，超低温保存存活率高。种子和花粉超低温保存必须选择适宜的含水量。预处理：目的在于提高植物材料的抗冻能力，减少冷冻损伤。主要采取以下几方面：(1)进行同步培养使细胞处于某一耐低温阶段；(2)进行逆境锻炼，加大培养基中蔗糖的浓度或增加透导增强抗寒能力的物质如脱落酸、山梨糖醇、二甲基亚砜等；(3)低温培养，冷冻之前将材料置于低温下培养，有助于增强其抗冻能力。冷冻保护剂：其种类和作用机理目前尚未透彻了解，对它的分类也无较好的方法，根据冷冻保护剂对细胞的渗透能力可分为两大类；第一类为渗透性保护剂，比较广泛使用的是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇，还有聚氧化乙烯、甲酰胺等。第二类为非渗透性保护剂，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等。冷冻保护剂的作用在于增强细胞的渗透性，防止细胞内结晶，稳定细胞内的大分子结构特别是膜结构，防止冷冻损害。各类冷冻保护剂可单独使用，也可配合使用，一般认为配合使用效果好；二甲基亚砜使用最广泛，但是浓度高时可能使细胞中毒，常用的浓度在5%～10%之间；二甲基亚砜同甘油、蔗糖、山梨醇配合使用都获得良好的冷冻保护效果。选择何种冷冻保护剂，同植物材料的类型、生理特性有很大关系，不同材料要求的冷冻保护剂类型、组合、配比都不一样，冷冻保护剂的使用研究是超低温保存的重要研究内容之一。冷冻降温：植物材料经预处理后，即可进行降温，最后在液态氮温度－196℃下保存；使用最佳冷冻速率使材料降温，细胞损伤最小，解冻后恢复率高，最佳冷冻速率同植物细胞的种类、细胞所处的时期、使用的冷冻保护剂种类有关，因此寻找试验材料的最佳冷冻速率是超低温保存领域的重要研究内容，也是影响保存效果的重要影响因素。目前使用的冷冻降温方法有：(1)快速冷冻：即直接将试验材料投入液氮。高度脱水的植物材料如种子、花粉以及某些抗寒的木本植物的枝条或芽，经过冬季的充分脱水，可采用快速冷冻法；有一些植物材料的茎尖分生组织，细胞小、质浓、液泡化程度低，也可用快速冷冻的方法。(2)慢速冷冻：使用冷冻速率控温装置，使材料按要求的速率降温，一般是0．5℃／min～4℃／min，在降温过程中使材料在某一温度保持一定时间慢速降温可使细胞内的水分外渗在细胞外结晶，从而避免细胞内结晶，提高成活率。多数的组织培养物具有较大的液泡，含水量高，降温时要采用适宜速率慢速降温。(3)二步降温法：第一步用慢速降温到一定的温度，一般降到－40℃，使细胞达到一定的保护性脱水；第二步将材料投入液氮，在材料降温到－40℃后，在－40℃下保持一段时间，有助于细胞充分脱水，明显提高成活率。目前低温保存植物材料多数采用二步降温法。保存后的解冻：超低温保存植物材料的冷冻伤害，主要在冷冻降温和解冻两个过程中发生。如果降温程序适合，细胞缓慢脱水，可避免细胞内结晶；如果解冻方法不适当，则解冻时细胞迅速吸水，造成细胞内再结晶，便会损伤膜结构，仍达不到良好效果。目前一般采用两种方法解冻：(1)快速解冻，即在35～40℃水浴中快速化冻。快速解冻对许多植物材料如花粉、种子、组织培养物都是适合的；(2)慢速解冻即在0～4℃冰箱内缓慢化冻，木本植物的冬芽、枝条以慢速解冻效果好。解冻方法同降温程序有关，一般认为样品脱水程度愈高，对解冻速度愈不敏感。生活力测定和再培养：为了鉴定保存效果必须测定材料保存后的生活力，对于种子可直接测定发芽率和生长势等项目。植物花粉可测定其染色百分率、离体萌发率及田间授粉结实率等。组织培养物的生活力测定，用TTC和二醋酸酯荧光素(FDA)染色法测定细胞损伤程度和死活，最重要的方法是将保存后的材料转移到新鲜培养基上进行再培养，观测组织细胞的复活情况、存活率、生长速度及分化产生植株的能力等。遗传稳定性分析：保存植物种质资源的根本任务，是既要保持种质的生活力又要保持该物种的遗传稳定。植物材料在超低温－196℃条件下处于相当稳定的生物学状态，不可能产生遗传变异。目前的研究资料证明，经超低温保存后的细胞的代谢产物、胚胎发生潜能、再生胚状体及植株的形态特征不变(Nag和Street，1973、1975；Uorich，1981)。1990年石思信指出，植物种子超低温保存8年，其发芽率、生长势及田间生长能力和农艺性状没有明显变化。但是，关于超低温长期保存后的植物种子材料遗传稳定性的研究资料还不多，以往的研究主要是探索技术方法，至1986年国际植物遗传资源委员会(IBPGR)才开始把低温和超低温长期保存后的植物种子材料的遗传稳定性研究作为一项国际合作项目。遗传稳定性分析，是超低温保存植物种质研究领域的重要环节之一，需进一步探讨的重要课题，它将为超低温保存技术应用于长期保存植物种质资源提供可靠性证据。【参考文献】：1 Manabu K，et al．Survival of dormant apple shoot tips after immersionin liquid nitroge．Hortscience，1983，18(5)：707～7082 Sakai A．Cryopreservation of shoot tips of fruit trees and bebaceous plants in kartha，K．K．(ed)Cryopreservation of plant eells and organs，1985，136～1573 Bajaj Y P S．Cryopreservation of plant cell cultures and lts prospects in agrichogy in Natesh．S．et al eds．Biotechnology in agriculture，1987，109～1314 马缘生，等．作物种质资源保存技术．北京：学术书刊出版社，19895 石思信，等．玉米花粉超低温保存一年后的结实能力．作物学报，1989，15(3)：283～286(中国农业科学院作物品种资源所石思信副研究员撰) |
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