| 单词 | 单克隆抗体技术在昆虫病毒研究中的应用 |
| 释义 | 【单克隆抗体技术在昆虫病毒研究中的应用】 1975年，科勒(Kohler)和梅尔斯坦(Milstein)创立的淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术，是当今生物学领域中可以和DNA重组技术相提并论的一次重大技术革命。用杂交瘤技术制备的单克隆抗体，与常规免疫血清(多克隆抗体)相比，具有特异性强、灵敏度高、质地均一、可以大量生产等优点，因而使其在近20年内得以迅速发展，并渗透到生物科学的许多领域。在植物保护科学中，已先后研制出多种植株病毒、细菌、类菌原体、螺原体、真菌、线虫和昆虫病线虫和昆虫病毒的单克隆抗体，并初步进行有关的应用研究，显示出其优越性和广阔的应用潜力。 1982年，西德(P．L．Robert)等首次研制出5株分泌对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。1983年，加拿大霍尔曼(A．W．Hohman)等也研制出34株抗苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒单克隆抗体。此后10年来，一些昆虫病毒单克隆抗体相继问世，包括花旗松毒蛾核型多角体病毒(L．Q．Rebacca，1984)、美洲棉铃虫核型多角体病毒(Y．S．Huang．1985)、粉纹夜蛾核型多角体病毒(L．E．Volkman，1984)、家蚕质型多角体病毒(三毛明人，1984)、大菜粉蝶颗粒体病毒和菜粉蝶颗粒体病毒(陈建国等，1988)、云杉卷叶蛾核型多角体病毒(P．Faulkner．1988)、家蚕浓核症病毒(陈建国等，1989)等10余种昆虫病毒单克隆抗体。病毒抗原结构分析及抗原决定簇定位 单克隆抗体的高度特异性，可用以鉴别不同昆虫病毒分离株间抗原结构的微细差别。在大菜粉蝶颗粒体病毒PbGV和近缘的菜粉蝶颗粒体病毒PrGV的研究中，1988年陈建国等根据不同的单克隆抗体与昆虫病毒分离株的特异性反应，可区别不同的病毒分离株，而PbGV的免抗血清(多克隆抗体)则与PbGV和PrGV的不同分离株都存在交叉反应，多克隆抗体不能区别不同病毒分离株，因而单克隆抗体可以识别出PbGV和PrGV不同分离株间的抗原性微细差异。他们根据单抗与各毒株反应结果，结合DNA相似度分析，提出PrGV和PbGV是抗原性有差异的同一种颗粒体病毒。单抗可与病毒的一个或数个抗原决定簇结合，因此根据单克隆抗体与病毒粒子特异性反应，可进行病毒抗原决定簇定位，并区别出病毒特有的或共有的抗原决定簇。用酶联免疫吸附测定表明，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)、单抗3F3和5E9杂交瘤细胞株抗原决定簇为32Kda的多角体病毒蛋白，而3D10细胞株抗原决定簇则为42Kda的病毒衣壳蛋白(P．L．Robert，1982)。进一步研究发现，3F3和5F9细胞株单抗在不同杆状病毒之间存在交叉反应，说明其抗原决定簇为杆状病毒共有，而3D10只与AcNPV表现特异性反应，说明其抗原决定簇为AcNPV所特有。霍尔曼等(1983)对AcNPV单抗研究也获类似结果。昆虫病毒的鉴定和分类 在自然界，苜蓿银纹夜蛾多角体病毒AcNPV存在OV型的和BV型的两种表型：OV型(PDN型)的，其囊膜是在结合进多角体蛋白基质前，在细胞核内形成，OV病毒主要起从罹病幼虫传染到其它幼虫的作用。BV型的病毒囊膜主要在感染虫体细胞膜以出芽方式产生，BV病毒在感染虫体内主要起在组织内相互传播的作用。OV和BV两种类型病毒其限制性内切酶谱相同，但其形态、生物学和生化上存在差异。用常规多抗血清很难区分这两种表型，而在制备AcNPV单抗以后，单克隆抗体不仅可把AcNPV与亲缘极近的云杉卷叶蛾多角体病毒分开，而且可把多角体和病毒颗粒分开，并可区别AcNPV和BV、OV两种表型(A．W．Hohman等，1983)；伏克曼等(L．E．Volkmen，1984)并由此建立了高度专化性的检测方法。运用单克隆抗体，可以指导人们鉴定和选择有效的生物杀虫剂。花旗松毒蛾，核型多角体病毒存在两种包涵体：多粒包埋型OpMNPV和单粒包埋型OpSNPV。OpMNPV是花旗松毒蛾的有效杀虫剂，已取得登记。OpSNPV尽管对花旗松毒蛾也可致病，但毒性不如OpMNPV。和OpMNPV抗原结构与理化特性相同，都包埋于多角体蛋白晶体中，常规免疫技术不能区别OpSMPV和OpSNPV。丽凡卡等(L．O．Rebecca，1984)制备了分别针对OpSMPV和OpMNPV多角体单克隆抗体，用单克隆抗体可区别这两种类型的病毒，并能用于检测罹病虫体提取物中的多角体。因此，单克隆抗体为鉴定，监测有效杀虫剂OpMNPV提供了手段。昆虫病毒的检测 在昆虫病毒流行病学方面，利用单克隆抗体进行检测，可有效地排除自然界存在的其他病毒毒株对检测的影响，灵敏、准确、迅速地检测田间虫体内病毒消长情况。用粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)单克隆抗体检测田间幼虫虫体内TnNPV发现，病毒侵染虫体后4h即可测出虫体内的多角体蛋白，而典型症状要在侵染后4d才开始表现(L．E．Volkman等，1982)。1988年，张光裕等应用单克隆抗体检测感染云杉卷叶蛾核型多角体病毒CFNPV的云杉卷叶蛾幼虫体内多角体病毒和病毒粒子，3龄幼虫饲喂表层涂有CFNPV人工饲料后6h，即可在幼虫抽提液中检出多角体蛋白抗原和病毒粒子抗原，随后此两种抗原量逐渐增加，直至第5d，而用染色涂片镜检法，则在添食病毒后3d才可观察到有少量多角体，病虫的病症需5～6d才出现。单克隆抗体特异性强，如AcNPV单抗3D10针对AcNPV和42Kda病毒衣壳蛋白，仅与AcNPV反应，而不与其它11种昆虫核型多角体病毒毒株的衣壳蛋白反应。运用蛋白质印迹－ELISA方法，灵敏度高，可测出10ng蛋白量或3×105个多角体的AcNPV。因此，这种方法可用于检测各种粗提液如感染血淋巴幼虫匀浆中的AcNPV W．C．Naser1982)。病毒感染昆虫细胞机理 1983年，霍尔曼等制备的AcNPV单抗中，A。V1单抗能识别BV型病毒，并可与BV病毒粒子发生中和反应，而不与OV型病毒发生反应。他们用这种具有中和BV病毒单抗研究BV病毒的出芽过程，发现在多角体形成之前，病毒出芽时期，单抗可与感染细胞表面发生反应，免疫电镜观察表明，抗原与中和性抗体反应在整个病毒囊膜上都可发生，但在Peplomers端浓度较高，用单克隆抗体可从BV病毒提取液中免疫沉降下4种蛋白，最主要的蛋白分子量约为64Kda，另3个蛋白质分别为127Kda，59Kda和49Kda。BV型病毒在罹病虫体内组织间传染。用单克隆抗体研究BV型病毒侵入细胞的途径，可能有两条不同的通道。单克隆抗体ACV1可阻断BV病毒利用较适宜的进入通道方式—－胞饮作用。进一步研究发现BV病毒未被ACV1中和的粒子可通过另一种途径进入细胞。比较AcNPV的两种表型(BV和OV型)侵染力的差异，在细胞间侵染BV侵染力优于OV，可能与两种表型病毒进入细胞机制有关，BV病毒通过胞饮作用进入细胞方式更有效(L．E．Volkman等，1985)。昆虫病毒分子生物学研究 在昆虫病毒分子生物学研究方面，单克隆抗体可用来作为探针，结合DNA基因文库，研究蛋白基因及进行DNA顺序测定。在病毒感染后期，杆状病毒可产生至少两种过量蛋白质，一种是29Kda的多角体蛋白，包埋病毒可抵抗不良环境，另一种蛋白P10其功能尚不清楚。许多学者对P10蛋白进行了研究。夸尔特－腊赛尔等(R．L．Quant-Russell，1987)研制了OpMNPV病毒粒子蛋白单抗，用蛋白质印迹试验，其中4株单抗可与OpMNPV病毒粒子14Kda蛋白发生反应，用这些单抗作为分子探针，可检出OpMNPV DNAλgtll表达文库中免疫反应克隆，通过来自λgt11克隆的插入DNA与OPMNPV基因DNA酶切片断杂交及对λgt插入末端定序，表明这些克隆含有P10基因片断，利用单克隆抗体，通过蛋白印迹和免疫荧光法对P10合成特性进行研究。在传染后14h可用萤光免疫显微镜测出P10蛋白质，感染后20h可形成染色致密的细胞质结构。用蛋白印迹试验，可观察到两种P10(14Kda和15Kda)蛋白质。P39是杆状病毒PDV和BV表型共有的一种最主要结构蛋白。皮尔逊等(M．N．Person．1980)制备了两株OpMNPV 39Kda蛋白的单抗，用蛋白印迹试验表明，两种单抗可与BV和PDV表型的OpMNPV病毒粒子39Kda蛋白发生反应。用其中一种P39单抗，通过蛋白印迹和免疫荧光染色技术，研究舞毒蛾细胞中P39合成特性，发现侵染后24h利用荧光显微镜可测出P39蛋白，48h后可在胞核中测出P39蛋白，而在细胞质中检出很少，或根本不能染色，说明P39蛋白从胞质运输到胞核中而降低胞质中P30浓度。用两种单抗从一个λgtllOpMNPV DNA表达文库中检出3株免疫反应克隆，通过用3株λgtll克隆的插入DNA与OpMNPA基因，DNA酶切片段杂交，对OpMNPV基因组上39Kka基因位点进行定位。利用λgtll插入DNA和单抗分析OpMNPV和AcMNPV和P39基因，表明在大小、DNA顺序和抗原性上OpMNPV和AcMNPV有密切联系。单克隆抗体技术在昆虫病毒鉴定、分类、田间早期检测、流行病学研究、基因产物定位上有广泛应用潜力。研制昆虫病毒单克隆抗体诊断试剂，逐步取代常规抗血清已成为大势所趋。今后，单抗结合其它技术如DNA重组，cDNA文库等，可进一步深入了解昆虫病毒的结构，功能和复制等机制。【参考文献】：1 Volkman L E，et al．J of Econe．Ecomol，1982，75(5)：868～8712 Robert P L，et al．Virology，1982，122：424～4303 Hohmann A W，et al．Virlolgy，1983．423～4444 Rebecca L Q，et al．Applied and Environmental Microbiology，1984，48(4)：732～7365 Akltomike，et al．J．Seric Sci Jpn，1984，53(1)：59～636 Volkman L E，et al．NPV by a mVirology，1984，133：354～3627 Huang Y S，et al．on the Pol Virology，1985．143：380～3918 Volkman L E，et al．Viology，1985，143：185～1859 陈建国，等．病毒学报，1988，4(2)：137～14110 张光裕，等．病毒学报，1988，4(1)：61～6411 陈建国，等．病毒学报，1989，5(1)：77～82(江苏农学院陆自强、胡广淦撰) |
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