“β－内酰胺酰化酶的分子生物学”的概念、定义、翻译、参考文献-科学参考

单词

β－内酰胺酰化酶的分子生物学

释义

【β－内酰胺酰化酶的分子生物学】

拼译：molecular biology of beta－Lactam acylase

1929年Fleming发现了青霉素，40年代初青霉素开始应用于临床，对人类的健康作出了巨大的贡献。近50年来，人们试图找到比青霉素更好的抗生素从而推动抗生素的研究与生产。目前，虽然从自然界已发现近8000种抗生素，但是，青霉素等β－内酰胺类抗生素仍不愧为抗生素中的佼佼者，它在整个抗生素工业总产值中占70%。不过，随着青霉素长期、大量地广泛应用，临床出现了病原菌耐药性的问题。因此，在β－内酰胺类抗生素构效关系研究的基础上，采取在天然母核上接不同的酰基侧链的方法。制出杀菌能力强、杀菌谱广、毒性低和耐酸性强的半合成β－内酰胺类抗生素已达3000多种，投放市场的也有近百种。半合成β－内酰胺类抗生素的研究与开发已成为当今抗生素工业中一个十分活跃的领域。

青霉素酰化酶(Penicillin Acylase，penicillin Amidase，EC3，5．1．11)水解青霉素产生酰基侧链酸和6－氨基青霉烷酸(6－ApA)，它是6－ApA生产中的重要工业用酶。根据酶底物专一性的不同，可分为青霉素V酰化酶、青霉素G酰化酶和氨苄青霉素酰化酶。其中研究较多、应用较广的是大肠杆菌青霉素G酰化酶，该酶具有较广泛的底物专一性，水解反应最适H⁺浓度10^－9～10^－7mol／L，在较高的H⁺浓度条件下可进行合成反应，苯乙酸为竞争性抑制剂，6－ApA为非竞争性抑制剂。在发酵过程中酶的形成需要苯乙酸的诱导，产酶适宜温度在28℃以下，温度高于37C时很少有酶的产生。此外，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜柠檬酸克鲁氏酵母(kluyvera Citrophila)、雷氏变形杆菌(proteus Retteqeri)、球形芽孢杆菌(Bacillus Sphaericus)、粘稠节杆菌(Arthiobacter viscosus)和假单孢菌(Psemdomonas sp．Strain G16)等青霉素酰化的研究也有不少报道。

国内外一些实验室都先后开展了大肠杆菌青霉素G酰化酶的基因克隆与表达的研究。Mayer等于1979年首先由大肠杆菌ATCC11105菌株克隆了青霉素G酰化酶基因，构建了5K(PHM12)高产工程菌。之后，Brus等和Oliver等发表了大肠杆菌青霉素G酰化酶的部分核苷酸序列。不久，Shumachaetr、Oh和郭礼和等3家实验室先后报道了3个不同大肠杆菌菌株青霉素G酰化酶结构基因的核苷酸全序列，他们得到的结果证明，大肠杆菌青霉素G酰化酶的结构基因是由4个功能DNA片段组成：(1)编码26个氨基酸残基先导肽(leader peptide)的78bP；(2)编码209个氨基酸残基的α－亚基的627bp；(3)编码54个氨基酸残基的间隔肽(Spacer peptide)的162bp；(4)编码557个氨基酸残基的1671bp。此外，调节片段包括5’－端的两个环化受体蛋白的结合位点(cyclic AMP－receptor protein，CRP)、一个启动子(－35’和－10六聚核苷酸)和核糖体结合位点(RBS)以及3’端的终止信号(Terminator)。青霉素G酰化酶基因表达的初级产物为94000的前体肽，它像许多真核生物激素一样，需要经过多步蛋白质加工，最后形成一个具有催化活性的酶分子。首先，先导肽被切掉，它使蛋白的分子输送到细菌细胞围膜空隙(Periplasmic Space)中；间隔肽切出后，产生α和β－亚基。据推测，在间隔肽的诱导下，两个亚基肽链折叠成特定的空间构象，此时，才成为有活性的酶分子，定位于围膜空隙。这种转译后的蛋白加工在原核生物中实属少见。实验证明，加工时大肠杆菌青霉素G酰化酶前体肽对温度是敏感的。

半合成头孢霉素比半合成青霉素具有抗菌谱广、毒副作用小、耐酸、不易产生耐药性等优点，因而它倍受重视。从20世纪60年代出现第1代半合成头孢霉素以来，发展到80年代已出现第4代半合成头孢霉素。7氨基头孢烷酸(7－ACA)是半合成头孢霉素不可缺少的中间体。7－ACA生产的传统工艺是化学裂解，其主要缺点是反应专一性差，产率低，副产物污染环境等。之后，便出现了酶促与化学处理相结合的“二步法”。但是，该工艺仍然存在操作步骤多、产率不高的问题。因此，人们试图通过DNA重组技术来改变这种状况。Isogai等人利用Fusarium Solani的编码D－氨基酸氧化酶(DAD)cDNA与Pseudmonas diminuta的编码戊二酰头孢霉素酰化酶(G1－7ACA acylase)的基因片段，成功地构建了一个合成7－ACA的杂合操纵子(Hybride operon)，在Acremonium chrysogenum的硷性蛋白酶调控元件的控制下实现表达，尽管含有该杂合操纵子的头孢霉素高产菌株A．Chrysogenum BC2116的转化子只产生很少的7－ACA，暂时还没有什么商业意义，然而细菌和真菌两种不同的基因结合在一起引入工业微生物中，必竟是一次有意义的尝试。为了直接将头孢霉C(CpC)转化为7－ACA，1987年，Matsuda等由pseudomonas SE83菌株克隆到分别编码为GL－7－ACA酰化酶(acyI)和CpC酰化酶(AcyⅡ)两个不同的基因，二者分别定位在2．5Kb和2．8Kb的DNA片段上，并完成它们的核苷酸的全序列测定，每个DNA核苷酸序列各有一个读框，编码两个大小不同的蛋白质亚基，其分子量为26000和57000。像大肠杆菌青霉素G酰化酶一样，头孢霉素酰化基因的表达初级产物也为一个前体多肽，经特殊蛋白加工后形成具有活性的酶分子。

acyⅡ基因表达产物虽能水解CpC产生7－ACA，但是产率极低。鉴于pseudomonas S E83 CpC酰化酶与大肠杆菌青霉素G酰化酶的氨基酸有较高的同源性，而青霉素G酶酰化有较广泛的底物专一性，它也能作用于某些半合成头孢霉素，这就暗示有可能通过基因定点诱变，改变大肠杆菌青霉素G酰化酶的底物专一性，开发出更有效的CpC酰化酶。在这方面，Williams等迈出了第一步，他们通过定点诱变，获得了若干个突变体，结果证明，α－亚基Met168与底物结合有关，对酶的底物专一性起着关键性作用。王敏等通过盒式定位诱变，得到了Ala177、Thr177、Gly177、Arg177和leu177等5个突变体，均失去了酶活性，即使在结构上与Ser相似的The也不能取代q－亚基上的第177位Ser，说明这个位置上的Ser是酶催化活性不可缺少的。

在酶的结构与功能研究方面，Hunt等人已获得可供衍射的单晶，随着青霉素G酰化酶的晶体结构被揭示，将为酶蛋白分子设计提供依据，青霉素G酰化酶的蛋白质工程研究将会达到一个新的水平，从而进一步推动半合成头孢霉素工业的发展。

【参考文献】：

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3 Oliver G and Valle F. Gene, 1985 ,40:9 ～ 14

4 Brus W,Hoppe. J Mol Appl Genet ,1985,3:30～44

5 Schmacher G and Sizmann.Nucl Acids Res, 1986,14 : 5713 ～5727

6 Oh S J. ,Kim,Y C. ,Park,Y W,Min,S Y.Kim I S,Kang, Gene.1987,56:87 ～97

7 Matsuda A,Matruyama K,Yamamoto K.Ichikawa S,kom-otsu ,.l Bacteriol ,1987.168:5815 ～ 5820

8 郭礼和，等．实验生物学报，1989，22∶99～110

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(中国科学院生物物理所张其玖研究员撰；门大鹏研究员审)

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