| 单词 | 林木原生质体培养 |
| 释义 | 【林木原生质体培养】 林木体细胞杂交和外源基因导入技术为林木改良展示了广阔的前景；通过原生质体融合进行体细胞杂交及用改建的质粒转化植物细胞以导入外源基因，将大大促进生物技术在林木改良上的应用。继1972年Rona首次报道对假挪威槭进行原生质体分离后，又陆续报道了对针叶树种原生质体的分离，但都未能获得再生植株。Rao等(1985)首先获得了檀香原生质体再生植株。Russell等(1986)用银白杨×大齿杨叶肉原生质体培养再生植株，并建立了成功的培养方法。随着培养方法的不断改进，北美鹅掌揪(Merkle etc，1987)、欧洲黑杨×毛果杨(Russell etc，1988)、欧洲山杨(Russell ete，1988)、毛白杨(王善平等，1990)、悬铃木(卫志明等，1991)、白花泡桐(卫志明等，1991)、美洲黑杨×辽杨(Parl etc，1992)、桑树(卫志明等，1992)、小叶杨(王影等，1992)等树种的原生质体培养先后获得了再生植株。 分离原生质体的起始材料1．材料的种类反选择。用于分离原生质体的林木材料，一类是愈伤组织和悬浮细胞，另一类是无菌苗的叶片即叶肉组织。建立高质量的胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系是林木原生质体培养成功的重要条件(王善平，1989)。为了建立胚性悬浮细胞系，首先要获得具有再生能力的胚性愈伤组织。植物的基因型、外植体来源、培养基的成分都与胚性愈伤组织产生的频率有关(Vahalaetc，1991)，且愈伤组织的再生能力不仅受基因型控制，也会随着培养时间的延长而变化，故在愈伤组织继代中要不断检测其分化能力(Hakman，1983)。王影(1991)认为，获得愈伤组织后要先调整其状态，形成淡黄色的、致密的颗粒状结构，选取这样的愈伤组织连续继代，可建立起生长快、分化率高的愈伤组织细胞无性系。对愈伤组织进行悬浮培养时，起始接种量很重要。接种细胞少时，细胞不易分裂；太多则易产生分化结构并使有害物质积累较多。培养液中2，4－D浓度，一般为0．5～3mg／L，过高会使细胞伸长最终丧失胚性，过低则抑制生长(Attree，1987)。胚性悬浮细胞的特点是细胞小、圆球形、壁薄、质浓，细胞系的特点是分散好、增殖快、培养液不混浊(Vahala，1991)。值得注意的是非胚性细胞一般比胚性细胞生长快，所以在继代中应注意选择胚性细胞团(王影等，1990)。悬浮培养液继代时间的长短，在很大程度上影响到所获得原生质体的活力和产量。通常继代时间为5～10d，但在游离原生质体前4～6周，相应缩短继代时间，以加快细胞分裂速度。选用换液后3～4d的悬浮细胞进行游离，所获原生质体活力高，得率亦高，且碎片少(Merkle etc．1987)，因此时培养细胞处于指数生长期，次生壁少，游离原生质体较容易(Teasdale etc．1983)。迄今为止，叶肉原生质体培养使大多数林木原生质体培养获得再生植株。无菌苗的生长状态对原生质体培养至关重要。卫志明(1991)从2个月悬铃木无菌苗上取基部向上第3、4充分伸展的叶片，经分离可获得大量健康有活力的原生质体，用FDA染色，活力达到95．4%，纯化后产量为3．7×106个／g鲜重。2．材料的预处理。许多林木原生质体培养的研究者都认为，酶解之前，将材料在溶液中进行预先质壁分离可提高细胞的耐受力，对原生质体分离有利。Russell和McCown在杂种杨叶片酶解之前，放在Omni-Mixer中预处理3～5s，可提高分裂频率。卫志明(1991)在悬铃木叶片酶解前，将其放在CPW－12M(含12%甘露醇)中1．5～2h，使细胞质壁分离，缩短了酶解时间。原生质体分离和培养1．分离和纤维化。分离林木原生质体的酶液一般是纤维素酶RS或R－10和果胶酶R－10和Y－23，有时亦加入半纤维素酶。渗透剂用甘露醇或山梨醇，一般为0．4～0．6mol／L，酶解时间为2～16h之间，在酶解后期用低速振荡，可提高原生质体的产量(Hodges．1988)。为获得较纯的原生质体，常采用蔗糖漂浮法去除未脱壁细胞和碎片。有时亦采用Peroll或Ficoll密度梯度离心的方法进行纯化，以防止原生质体的大量流失(王善平等，1990)。2．培养基。为了使获得的原生质体在培养中能持续分裂生长，最重要的条件之一是选择合适的培养基。由于原生质体没有细胞壁包裹，培养基中成分直接与细胞膜接触，对原生质体的影响较之于细胞可能会更强烈，故原生质体对培养基的要求比细胞培养基更加苛刻。很多木本植物原生质体培养都采用MS培养基(Murashige & Skoog，1962)、WPM培养基(Russell & McCown。1986．6)和Km8p培养基(Kao & Michayluk，1975)。培养基中的氮源对原生质体的生长是必要的，但普遍认为高浓度的NH4对原生质体发育有抑制作用。Russell等(1986)发现，培养基中加入NH4NO3尽管能保持杨树原生质体膨胀及细胞壁的再生，但两周后细胞死亡；而在完全去除了NH4NO3的培养基上则获得成功。同样的情况亦出现在柳树原生质体培养中(Vahala，1991)。他们认为，降低NH4NO3浓度能维持细胞的持续分裂，原生质体可以在KNO3为唯一氮源的培养基上生长，但以KNO3附加低浓度的NH4NO3时培养效果最佳。培养基中的碳源和渗透剂在原生质体培养中起重要的作用。在培养初期，由于原生质体无细胞壁，培养基保持高渗状态是必要的。Rusell等(1986)以0．62mol／L蔗糖作碳源，使杨树原生质体分裂频率达到80%。Park(1992)以0．6mol／L甘露醇为渗透剂，使杂种杨一裂率达到36．1%，但持续分裂能力差；而以0．2mol／L甘露醇+0．4mol／L葡萄糖进行培养，尽管一裂率只有32．4%，但持续分裂能力很强。王善平(1990)在毛白杨原生质体培养中发现，只有用葡萄糖作为渗透剂，才能成功地克服细胞大量粘连及细胞解体的现象。王影(1992)在小叶杨培养时发现，虽然0．4～0．7mol／L的渗透都能启动细胞分裂，但如果渗透高于0．5mol／L，细胞会逐渐解体死亡。越来越多的试验证明，用葡萄糖作为林木原生质体培养基中的碳源和渗透剂，可获得较高的植板率，且对细胞的毒害也较小(卫志明等，1991；Park，1992)。原生质体培养中应用的激素以生长素和细胞分裂素为主。培养前期，为启动细胞分裂，生长素的作用往往更重要。Vahala(1991)认为，2，4－D在柳树原生质体培养中的作用是NAA和lAA不能代替的。多种激素配合使用效果也较好。卫志明(1991)在悬铃木原生质体的培养基中添加0．5mg／L2，4－D+0．5mg／L BA+1．0mg／L NAA，14天后分裂频率达26．8%。3．原生质体培养方法。大致可分为液体培养、琼脂糖包埋和看护培养等几种方式。许多林木原生质体都采用液体浅层培养而获得成功，如悬铃木(卫志明等，1991)、泡桐(卫志明等，1991)、桑树(卫志明等，1992)、毛白杨(王善平等，1990)。Park(1992)在杂种杨原生质体培养时采用四种方法：悬滴、琼脂包埋、液体浅层和微孔滤膜看护。实验结果表明，浅层培养的细胞分裂频率最高(48．6%)，而微孔滤膜看护培养的植板率(22．8%)要高于其他两种培养方法。Russell(1986)在杨树原生质体培养时，设计了一种新的看护培养方法，将一张有许多微孔的聚酯片漂浮在培养液中，这样有活力的原生质体浮游在聚酯片上，而死细胞和碎片则沉入底部，净化了培养环境，有利于原生质体生长。用这种方法，Russell成功地得到了3个杨树杂种的或无性系的再生植株。原生质体的植板密度对培养影响很大，不同基因型其要求也各不相同。王善平(1990)在毛白杨原生质体培养时发现，植板密度为2．5×108／L时，分裂频率为20．3%；植板密度为5．0×108／L时，虽可见一次分裂，但如不及时降低细胞密度，则不能持续分裂。故在原生质体培养后期，调整培养密度对提高培养效果是很重要的。原生质体再生成株 一般在原生质体长成肉眼可见的小愈伤组织后，即要转到分化培养基上诱导分化。分化培养基与原生质体培养基的重要区别在于：以不加高浓度的糖类作渗透剂，生长素与分裂素的浓度比与前期相反，细胞分裂素起主要作用，生长素浓度逐渐降低。不同的材料对细胞分裂素的要求有显著的差异。Park(1992)发现，一定浓度的2ip和ZT能诱导杂种杨产生芽，而BA却不能。Saxena指出，原生质体早期分裂需要2，4－D存在，但在培养后期为获得芽的分化必须将其去除，否则，细胞团就会迅速生长形成松散的愈伤组织，而这样的愈伤组织要进一步分化是很困难的。关于原生质体愈伤组织丧失分化能力，也有人认为是由于染色体发生变异所造成的。然而小麦原生质体培养结果表明，染色体数目变异与愈伤再生能力之间没有必然的相关性(Chang等，1991)。林木原生质体培养中未见有关报道。4．植株再发。当芽在培养基上伸长到3～5cm时，就可以从基部切下，转移到生根培养基上诱导根的分化。生根培养基一般不含激素或含低浓度的生长素，在2～3周内就可形成发达的根系，从而完成从原生质体到再生植株的整个过程。阔叶树种的原生质体培养，一般以试管苗叶肉细胞为起始材料，它的优点是材料的状态较整齐且好控制，游离的原生质体大小一致、比较饱满，染色体的变异相对较小。缺点是先要建立无菌苗繁殖体系，所以组织培养工作首先要过关；再则叶肉原生质体较难分裂形成愈伤组织。针叶树种和部分阔叶树主要是从建立细胞悬浮系的途径培养原生质体的。这个途径的缺点是建立胚性悬浮细胞系在很大程度上要凭经验，而且工作量大，随着继代时间的延长，会发生染色体变异，可能导致再生能力的丧失。在现有的培养技术下，使悬浮细胞分离的原生质体分裂形成细胞团和愈伤组织已不是很困难了，而主要的困难在于建立胚性悬浮细胞系和使原生质体愈伤组织再生成株，其实质就是如何调控细胞团和愈伤组织的状态，归根到底这是基因的调控问题。林木原生质体再生植株的关键，首先在于选择合适的基因型。植物种或品种之间离体培养再生能力存在着差异。在林木组织培养中，落叶阔叶树再生能力＞常绿阔叶树＞针叶树，林木原生质体培养中存在着同样的趋势。在愈伤组织的诱导中，幼胚诱导的胚性愈伤组织的频率最高。Bekkavai(1987)等用白云杉幼胚诱导脱分化，4个月后就可形成胚性愈伤组织。Gupta等(1987)用火炬松幼胚建立的胚性悬浮细胞系分离原生质体，最终形成体胚。Sticklen等(1986)利用先锋榆嫩叶诱导的愈伤组织进行原生质体分离和培养，亦获得了再生植株。由此可见，根据不同树种选择生理状态好的幼嫩组织器官作为起始材料，是开展原生质体培养的重要条件。培养基对原生质体培养的影响很大。由于林木基因型差异较大，故不同物种对培养基的要求亦不同。对北美鹅掌揪(Merkle，1987)和蒿柳(Vahala etc，1991)采用MS(Murashige &．Skoog，1962)培养基，杨树(Rusell，etc，1986)采用WPM(Rusell &．McCown，1986)培养基均获得再生植株。卫志明用K8P(Kao，1977)培养基先后获得了悬铃木(1991)、桑树(1992)和泡桐(1991)3个树种的再生植株。在有些树种中，营养丰富的Km8P(Kao &．Michayluk，1975)培养基并不一定优于MS和WPM培养基。Park等(1992)在杨树杂种的原生质体培养中共选用MS、ACM、WPM、B5和Km8P 5种培养基，结果发现在MS和WPM培养基上原生质体分裂频率为46．5%和44．5%，远远高于B5和Km8P的18．4%和32．3%，而MS的植板率(20．6%)又高于WPM的植板率(14．5%)，故认为杨树杂种的原生质体培养只需要较少的有机化合物和维生素，多了反而不利于原生质体生长。此外，培养基的渗透势对调节原生质体的状态亦很重要。渗透压过高，原生质体会发生皱缩直至失去活力；渗透压过低，原生质体膨大并破碎，故在酶解和初培养时，保持合适的渗透压是非常重要的。随着原生质体培养时间的延长，可逐步降低渗透势以提高细胞的耐受力。目前用作原生质体培养的渗透剂一般是葡萄糖(王善平等，1990；王影等，1991；Russell etc．1986；Sticklen etc，1986)，而Merkle等(1987)以蔗糖和甘露醇作为渗透剂培养北美鹅掌楸原生质体也获得再生植株。Cka等(1985)在构树原生质体培养中发现，使用蔗糖和果糖虽能使细胞发生1～2次分裂，但子细胞无淀粉积累且细胞质稀少，活力降低，而使用葡萄糖则可使细胞持续分裂。邓占鳌(1990)以麦芽糖作为渗压剂培养柑桔原生质体取得了很好的效果。原生质体的植板密度对后期生长的影响也是非常显著的。林木原生质体的植板密度变化很大，不同基因型的要求都不一样。火炬松最适密度为5．0×107个／L(Teasdale etc，1983)，海岸松为2．0×109个／L(David etc，1979)。榆树植板率为5×107个／L时，原生质体分裂率可达19%，植板率为1．0×107和1．0×108个／L时，分裂率则降为15．40%和7．76%(Stickle etc，1986)。王善平等(1990)在毛白杨原生质体培养中发现，如植板密度高于5．0×109个／L时，虽可见一次分裂，但如不及时降低培养密度，则不能进行持续的细胞分裂，故在培养后期合理调整培养密度对提高原生质体培养效果是很重要的。目前，许多林木原生质体再生植株，采用的都是分步培养的方法，第一步，将新分离的原生质体液体浅层培养，培养基多为营养丰富的Km8P，激素以生长素为主，加入少量的细胞分裂素，此时原生质体很娇嫩，处于高渗状态，有利于细胞壁形成和促进分裂；第二步，在原生质体培养后期，通过加液不断降低渗透势，同时提高细胞分裂素浓度，降低生长素浓度，使细胞团在增殖的同时具有潜在的分化能力，待细胞团长成肉眼可见的小愈伤组织，用吸管吸出，在固化的MS或WPM培养基上铺以薄薄的一层，促进其增殖；第三步，当小愈伤组织长大后，就转移到分化培养基上诱导分化，培养基以MS最常用，细胞分裂素则以BA、ZT、KT和2ip为主；采用此法获得成功的有毛白杨(王善平等，1990)、悬铃木(卫志明等，1991)和泡桐(卫志明等，1991)等。80年代以来的研究成果表明，林木原生质体的培养已取得了突破性的进展，为体细胞杂交和外源基因导入创造了良好的条件。但总的来讲，由于树木在自然界一般都是自然授粉，基因型高度杂合，而且林木细胞和组织培养的研究基础比较薄弱，这些都给原生质体培养带来许多问题。随着对林木各种基本生命活动的深入了解和对培养方法的改进，林木原生质体的培养一定会取得更大的发展，并将在遗传育种研究中发挥愈来愈重要的作用。【参考文献】：1 Julie A Rusell，et al．Plant science．1986，16：133～1422 Julie A Russell，et al．Plant cell reports，1986，5：281～2873 Attree S M，et al，Plant cell reports，1987，6：180～4834 王善平，等．中国科学(B)，1990，(12)：1260～12635 卫志明，等．植物学报，1991，33(11)：813～8186 孙勇如，等．植物原生质体培养，北京：科学出版社，1991，116～1227 王影，等．南京林业大学学报，1991，15(3)：31～368 Lima Vahala，et al．Plant cell，trssue and organ culture．1991，27：213～2489 Emily E Chesick，et al．Plant cell，trssue and organ culture，1991，26：107～11410 卫志明，等．植物生理学通讯，1992，28(4)：248～249(林业生物技术研究中心王影、黄每仁撰) |
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