| 单词 | 哺乳动物胚胎的性别鉴定方法 |
| 释义 | 【哺乳动物胚胎的性别鉴定方法】 哺乳动物的性分化是胚胎发育期间在子宫内进行的，有着高度的保存性，要想通过外界因素对其产生影响十分困难。因此，将鉴别已经形成的胚胎的性别称为“性别鉴定”。通过性别鉴定，再进行胚胎移植或中止妊娠即可达到选择后代性别的目的。在当前进行此项研究工作的主要方法如下： 细胞遗传学分析 又称为“细胞核型鉴定”，即通过检查细胞的染色体或组型束进行判定。这种方法是将被鉴定的胚胎用含有丝分裂阻滞剂的培养液培养，然后诱使细胞肿胀及染色体扩展并加以固定，用永久性DNA染料如姬姆萨液染色，以显微镜检查。其性别鉴定的准确率可达100%，但需要在高质量的中期染色体分散相下才能作出鉴定，因此难度甚大，且费时较多。目前，可以从12～15日龄牛胚胎取下一小块滋养层细胞分析，也可以从6～7日龄牛胚胎取少许活细胞或经胚胎分割后，分析其半胚的性别。此种方法目前虽然还难以应用于生产，但是可以用来验证其他鉴定方法的准确性。连接酶活性测定 正常哺乳动物的雌性具有两条X染色体，雄性只有一条X染色体。早期雌性胚胎的两条X染色体中必有一条失活，以保持两性之间相同数量的基因。但是X染色体失活的精确时间目前尚难以确定。在胚胎基因活化与X染色体失活之间得知有一短暂时间，在此期间雌性的两条X染色体都可被转译，因此在雌性胚胎中存在有一种与X染色体连接酶的浓度和活性是雄性胚胎的两倍。Willams对桑椹胚到囊胚的小鼠胚胎测定X染色体连接酶6一葡萄糖磷酸脱氢酶(G6PD)的活性，雌性胚胎和雄性胚胎的鉴别准确率分别为72%(62／66)和46%(39／84)。Monk及Handyside(1988)用去透明带的8细胞小鼠胚胎检查X连结酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的活性，同时测定了常染色体连结酶腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)的活性，对雌性的及雄性的胚胎性别鉴定准确率分别为91%(11／12)和100%(3／3)。由于家畜X染色体失活的确切时间尚不清楚，因此按X染色体连接酶活性进行性别鉴定时，有些雌性胚胎会被误判为雄性。H-Y抗原法根据 H-Y抗原和H-Y抗体反应，可使雄性胚胎发育停止。研究资料表明，哺乳动物在8细胞至早期胚胎期，雄性胚胎即表达出一种雌性胚胎所没有的细胞表面分子，即组织相容性抗原(H-Y抗原)，它仅存在于雄性细胞染色体。其方法是将雄性个体的细胞注入同一自交系的雌性个体内，制备出抗雄性特异性抗体，经过一系列复杂的过程，将有用的抗血清筛选出来，然后将胚胎放在一定的抗血清中或补体中，利用其毒性杀死雄性胚胎。White(1982)用1000枚8～16细胞的小鼠胚胎进行试验，鉴定出479枚(48%)雄性胚胎，将未受到伤害的胚胎进行移植，得到86%的雌性小鼠。还有一种方法是通过免疫荧光法判定性别。先将胚胎用H-Y抗体(多抗或单抗)处理30分钟，再用与异硫氰酸盐荧光素(FITC)结合的二抗处理，根据特异荧光来判定其性别。White等(1987)鉴定了258枚从4细胞到囊胚阶段的牛胚胎，将出现有荧光反应的定为雄性的84枚胚胎中有67枚(79%)核型为XY，原定为雌性(无荧光反应)的65枚胚胎中有58枚(89%)核型为XX。目前已有人报道分析H-Y抗原的新方法，如单克隆抗体法(Anderson1986、1987)。也有人在分析方法中用辣根过氧化酶代替荧光物质，或者用生物素——抗生素蛋白来增加结合到第2抗体上的酶含量。H-Y抗原法虽然始于1975年，但因需要大量生产抗体，故在实际应用中尚很困难。Y特异性DNA探针 这种方法是从胚胎取下少许细胞，将其DNA与已知的Y染色体特异性的标记DNA序列作为探针进行杂交，如果样品中含有与这种探针互补的碱基序列，那么探针就可以与其结合，结果为阳性，则说明有Y染色体存在，胚胎则为雄性。制备和确定Y特异性DNA探针过程包括：分离Y染色体序列，分离Y特异性序列，确定探针序列在Y染色体上的位置及拷贝数。Bondidi等报道，利用3种重复序列Y特异性DNA探针对6～8日龄的牛胚进行性别鉴定，在两组实验中分别有76%和85%的胚胎能够鉴别出性别，70例结果全部准确。Leonard等人又进一步用生物素标记的牛Y特异性探针进行原位杂交，结果有59%(85／150)的胚胎能够作性别鉴定，准确率达100%。用生物素作标记较放射性标记设备简单，技术难度低，无放射性。聚合酶链反应 用两个特异性的雄性Y染色体重复序列为标靶，以聚合酶链反应(PCR)方法对胚胎活组织样本中雄性特异DNA序列进行扩增。PCR是一种较复杂的技术，其关键需将多种试剂配成一种反应合剂，含有TaqDNA聚合酶、缓冲剂、去氧核苷酸三磷酸盐和两对低去氧核苷酸引物，一对用于扩增Y染色体重复DNA的132bp片段，另一对用于扩增226bP的常染色体重复片段。每批合剂在使用前可通过测定一部分样本进行质量检查。进行Y染色体测定时需从牛胚胎上取下2～10个细胞，用2对牛Y染色体特异性引物和1对牛DNA特异性引物进行鉴定，经琼脂糖凝胶电泳测定发现雌性胚胎仅有一个条带，为牛特异性引物所产生，而没有Y染色体特异性引物产生的条带。雄性胚胎则显示有两对引物双条带和一个有Y染色体特异性引物的单条带。用12枚胚胎进行性别鉴定，其准确率可以达到92%(11／12)。有的试验结果准确性可达100%，可用于90%以上的牛半胚性别鉴定。上述几种胚胎鉴定方法比较起来各有其特点，同时也存在许多需改进的地方。细胞遗传学方法是以核型作胚胎性别鉴定，准确率虽然很高，但只有60%～70%的胚胎能供作鉴定，操作方法费时间，又需较高的技术及经验，因此其商业应用价值很小，但可作为验证其他性别鉴定技术的有效方法。免疫学方法是通过H-Y抗原测定作胚胎性别鉴定，因为对胚胎的损伤不大，所以具有较为理想的妊娠率，现已进一步采用有效的酶分析方法来判断结合的抗体，使用成品药盒，会使此种方法更为实用，便于推广。采用X染色体连结酶鉴定胚胎性别，一旦解除对胚胎的毒害作用，此种技术的应用前景是很广阔的。用DNA探针鉴定胚胎性别，需要制备高特异性的Y染色体探针，还应对家畜的Y染色体作更多的基础研究，此法比起其他对胚胎带有损害性的方法仅需要较少的胚胎组织样品，如能改用非放射性探针，将会使得这项技术更有实用价值。聚合酶链反应法的应用，被认为是胚胎性别鉴定方法的一大突破，胚胎利用率及性别鉴定准确率均很高，很有希望能在生产中得到应用。目前，虽然尚无一种胚胎利用率高、性别鉴定的准确率高、胚胎经移植后的成功率高、费时少、费用低、操作简便的满意方法，但经多年来的研究已取得了长足的进展，在不远的将来定会建立起一种理想的胚胎性别鉴定方法在生产实践中得到应用。【参考文献】：1 Seidel G E Jr．11 tn Intern Conq on Anim Reprod and Al proc．1988．136～1452 Van Viiet R A，等，Theriogenology 1989，32(3)：421～4393 铃木达行，等．家畜繁殖杂志，1989，5：29～564 金川弘司，等．家畜繁殖杂志，1989，5：57～825 Charles M．Herr：Theriogenology，1990，33(1)：245～2476 赵兴绪．草食家畜，1991，5：20～237 Peura T等．草食家畜，1991，5：18～19(西北农业大学渊锡藩撰) |
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