| 单词 | 哺乳动物的体外受精 |
| 释义 | 【哺乳动物的体外受精】 体外受精就是将从母体采收出的卵子与经获能后的精子在体外条件下完成受精过程而形成胚胎的生物工程技术。它包括有卵母细胞的培养、精子获能处理、卵母细胞的受精、早期胚胎的培养及移植等一系列程序。 早在1878年，澳大利亚科学家Schenk曾用兔子作过体外受精试验，以后也有几篇研究报告，但均未获得成功。1951年，张明觉和Austin确定了精子在授精前必须经过获能才能与卵子结合，使体外受精技术有了突破性进展。1956年，Whitten在胚胎培养液中加入牛血清白蛋白，使细胞期胚胎可以发育到胚泡期，为移植体外受精发育的胚胎奠定了基础。1959年，张明觉首次获得了世界上第一批体外受精小兔。于是人们将经体外受精出生的动物称为“试管动物”。从1961～1987年，世界上已相继有山羊、绵羊、鼠、猫、猪、牛、狗、猴等20多种哺乳动物的体外受精获得成功。截止1990年，已有大鼠、小鼠、人、猴、牛、山羊、绵羊、猪、虎等12种动物获得体外受精的后代。20世纪80年代，中国开始研究体外受精，虽然起步较晚，但发展速度很快。1986年，江苏农业科学院范必勤获得体外受精仔兔。1988年，北京医科大学唐士芬获得试管婴儿。1989年，内蒙古大学旭日干获得试管绵羊羔和试管小牛。1990年，范必勤又获得了8只试管小猪。80年代后期，随着胚胎工程、细胞工程和基因工程技术的快速发展，对哺乳动物的受精卵及胚胎的需要量不断迅速增长，仅依靠超数排卵技术来获得卵子已远远满足不了研究和生产的要求，因此除了实验动物及野生动物外，已开始从屠宰场收集废弃的家畜卵巢中未成熟的卵母细胞，经体外培养成熟后，应用体外受精来获得大量受精卵及不同日龄的胚胎。卵母细胞在体外培养成熟过程中，因物种、卵母细胞类型、培养液和是否加入血清、激素以及培养温度和气象条件等不同，而影响着培养卵母细胞的成熟率和受精率。目前对动物卵母细胞的成熟机制尚不清楚，除可从核的形态学形态学变化判定外，在卵丘细胞、卵膜和卵质亦发生着成熟变化，这不仅影响其受精效果，更重要的是影响早期胚胎的发育。在正常情况下，卵母细胞的卵丘细胞群的扩展状态能反映卵核成熟阶段，二者为同步发育。应用促性腺激素(FSH+LH)对卵母细胞的体外成熟具有明显的促进作用，诱发卵丘细胞的扩展，加快破坏卵细胞与卵丘细胞的联系，从而启动卵母细胞内的核成熟。当卵丘细胞扩展后，卵丘细胞之间以及卵丘细胞与卵细胞之间的联系消失，卵膜通透性改变。此后卵母细胞的发育便不再受促性腺激素的影响。目前，应用Earles、M199及HamsF－12作为卵母细胞的基础培养液，培养家畜的卵母细胞已获得稳定的成功效果。在培养液中加入胎牛血清、犊牛血清、发情牛血清均可提高培养成熟卵的受精率。卵母细胞在37～39℃的环境中培养24～26h，成熟率及受精发育率均较高。近20年来，科学家们虽然对20多种哺乳动物的卵母细胞进行体外受精的研究已经获得成功，但经体外培养成熟的卵母细胞体外受精率及受精后的发育率还很低。虽然已有12种动物的体外受精后代产生，但其妊娠产仔率还很低。目前，人类对卵母细胞的体外发育和成熟研究尚不深入，今后将会对此方面给予高度的重视。精子的体外获能是在含有某些特殊物质如高离子强度液、Ca+载体、脂类、肝素、血清等的培养液诱导离体精子完成如同在母体生殖道内的获能过程。将经过获能处理的精子与成熟卵子置于受精液(和精子获能液相同)中共同培养8～12h，再将卵子移入发育培养液中，体外受精过程即完成。在实验室条件下完成精子和卵子的体外结合应注意两个方面的问题。一是所用精子的数量应适宜。精子数量过多，往往会引起多精子授精，而精子数量过少则又会影响受精率，因此要控制精子的适宜数量，以获得正常的单精子受精卵。二是精子和卵子共同培养的时间要适宜。精子获能是为顶体反应做准备，精子顶体如果过早地释放出顶体酶，就会失去与透明带结合的位点，会被抑制因子或自身水解酶灭活，精子的活力提早丧失，失去和卵子结合的能力。同样如果卵子没有完全成熟或老化，也会影响精子入卵和雌原核的发育。因此，靠推好精子和卵子相遇的时机，是体外受精甚至早期胚胎正常发育的关键。Lassalle等(1987)利用精子注射法进行体外受精，是在仓鼠上进行的，最适宜的注射时间是在卵子刚受精后的两原核形成期。精子形成雄原核需要在激活后的卵子内，这种卵子应处于排出第二极体形成雌原核阶段。此时的受精卵依然可形成阻止多精入卵的屏障，不再与第2个精子结合。实验表明，利用精子注射法可将一些形态异常、运动不规则甚至不运动的精子注入卵内进行授精。这样便有可能使人类及一些优良种畜的不育个体得到后代，在医学及畜牧业生产中具有重要意义。另外，由于目前在体外受精研究中，精子必须经获能处理，而肝素及钙离子载体等获能培养剂的效果还不甚理想。如果将未经获能的精子注入卵子后能进行正常受精，则可大大加速“试管动物”的生产进程。近来有人将精子注入到卵周隙内，这样既简化了操作，对卵子的损伤也小，还能保持卵黄膜对精子的选择作用。但是也应指出，由于至今还未对精子注射后形成的胚胎发育进行全面的研究，因此还难以断定这些异常精子的基因型是否正常。受精卵的体外培养已在牛、绵羊、猪、山羊等方面获得成功，但和再移入输卵管内的体内培养相比较，其成功率还很低。体外培养受精卵所用的培养液是和卵细胞成熟所用的培养液基本相同，培养效果不佳，早期胚胎在培养过程中往往发生停滞现象。为此，许多研究者改用共同培养技术和在培养液中添加辅助成分的方法。共同培养法是将受精卵与某些细胞混合在一起培养的技术，有滋养层细胞、颗粒细胞、成纤维细胞、黄体细胞、子宫内膜细胞、输卵管上皮细胞及其他器官细胞等。其中以输卵管上皮细胞培养效果较好，可能因此类细胞能为胚胎提供多肽类(如促胚胎分裂素)或脂类，以调节胚胎发育。此类细胞还可除去培养液中的或在胚胎代谢过程中产生的有毒化合物。在培养液中添加的辅助成分有丙酮酸钠和乳酸钠及葡萄糖、血清等。这两种培养剂均能在不同程度上提高动物受精卵的发育率。综上所述，随着卵母细胞的体外成熟培养、体外受精和早期胚胎培养、胚胎移植等技术的发展，有的国家已经成立了经营胚胎的公司，将由屠宰场收集的卵巢应用于体外受精技术，以工厂化形式大批量生产胚胎，开辟了丰富的胚胎资源，大幅度地降低了生产成本。在中国内蒙古已初步形成了绵羊胚胎生产线。野生的、珍奇的动物以及经济动物也会尽快地用体外受精技术进行繁殖后代和种质保存。【参考文献】：1 Meinecke B，et al．Theriogenology，1979，11：351～3652 Moor R M，et al． Eocp cell Res，1980，126，15～293 Minato Y，et al．Jpn J．zootech Sci，1982，53：480～4874 Powers R D J．Exp zool，1982，221：365～3715 Thibault C，et al．Reprod Nutr Develop，1987，25(5)：865～8966 Gradl E，et al．11th Intern Conq on Anim Reprod and Al proc 1988，136～1457 Katskal，et al．Therilgenlogy 1989，32(5)：767～7778 杨增明，等．国外畜牧科技，1989，2：21～309 山崎由纪子，等．家畜繁殖学杂志，1990，4：189～19410 福井丰．畜产の研究，1991，5：605～606(西北农业大学张一玲撰) |
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