| 单词 | 酶联免疫吸附法 |
| 释义 | 【酶联免疫吸附法】 酶联免疫吸附法(ELISA)是一项基本的免疫测定方法。以ELISA为代表的固－液抗原抗体反应体系，大有取代经典的以同位素标记为基础的液－液抗原－抗体反应体系。 抗原包被的质量是影响固－液抗原抗体反应的重要因素。ELISA使用的微孔板通常为聚苯乙烯板，它和蛋白类抗原有较强的相互作用。目前蛋白类抗原的包被技术已经相当成熟。包被技术的改进主要集中在对聚苯乙烯亲和力较弱的抗原、短肽、完整细胞及多糖类抗原等的包被上。半抗原通常以半抗原－载体结合物的形式包被，既能克服半抗原在微孔板上不易吸附的弱点，又为抗原－抗体反应提供合适的空间环境，胡昌勤等在对头孢菌素半抗原的分析时发现，半抗原通常也存在多个抗体结合位点，且各位点在与抗体的结合过程中所起的作用不同，因此和载体结合后，主要抗体结合位点的结构及空间构象不能有太大的改变，否则和抗体的结合作用将减弱。Tiefenauer等对类固醇类半抗原的研究得出相同的结论，蛋白质是最常见的半抗原载体，但用半抗原－蛋白质做包被抗原存在两个主要问题：包被抗原制备的重现性不好，且贮存中不稳定；易和抗血清(体)发生交叉反应。T．A．Verschoor等(1990)报道，尼龙(如尼龙6)可作为半抗原的载体。由DCC为交联剂制备的半抗原－尼龙结合物不仅在室温放置稳定，用苯酚－乙醇溶解后即可在微孔板上包被。P．Ordronneau等(1991)利用戊二醛(GA)将含有氨基的半抗原直接与微孔板连接，并以此为基础建立了可行的ELISA操作程序；虽然上述两项研究均克服了用半抗原－蛋白质包被的弱点，但使用中半抗原－尼龙可能更方便。短肽类抗原在微孔板上的吸附情况差异很大，某些短肽极难包被。M．Zouali等(1991)报道，利用UV辐射处理微孔板可增强短肽在微孔板上的亲合力，包被的情况可用生物素－抗生物素－过氧物酶技术(G．E．Griesmann等，1991)来检测，对某些来源困难的短肽，可将其羧基直接与经修饰的微孔板共价连接(J．S．Ardersen等，1990)，该方法不仅能减少抗原在包被过程中的丢失，且使ELISA的灵敏度及重视性都有所提高。对小分子抗原包被的另一新进展反映在对金属元素的包被上。抗金属元素抗体是近年来的新发现，S．M．Clark(1991)采用电子束喷镀法实现了对金属铍的包被，并对抗铍抗体进行了ELISA分析。ELISA还可用于分析细胞膜表面抗原，虽然某些细胞经空气干燥即可吸附到微孔板表面，但通常需用戊二醛固定细胞。K．Carroll等(1990年)报道，戊二醛的最适浓度(可有效固定细胞，但不引起抗体非特异吸附)和微孔板的材质及检测细胞的特性有关；其最适浓度范围(0．05%～0．025%)非常窄，这些结果有助于对实验条件的选择。多糖类抗原通常需经化学修饰以增强和微孔板的亲和力，但利用真空过滤技术(S．H．Feng等．1991)可使之直接吸附到硝酸纤维素膜(NC)上，包被在NC上的抗原可由酶免疫法检测，从而避免化学修饰过程中抗原性的改变。K．O．Smith等(1991)尝试在经聚四氟乙烯处理的盖玻片上包被抗原，并取得对HIV抗体的检测成功，该方法耗用的试剂量仅为5～10μl，花费比所有其它ELISA都低。ELISA的检出线虽然已经达到10－8～10－12g，但对某些测定仍需有更高的灵敏度。传统ELISA中显色剂发色团的吸光度是限制ELISA灵敏度提高的主要因素，虽然改用荧光标记或其它化学发光物标记抗体替代酶标记抗体可以提高灵敏度，但它们的应用受到设备条件的限制。提高ELISA灵敏度的主要途径是采用酶放大系统，已经有多种酶放大系统，如M．N．Bobrow等(1989)的CARD法，利用与抗体偶联酶的一级反应，去引发已经包被到微孔板上的2级反应系统，以实现放大作用。R．Leieune等(1990)利用亲和色谱技术发展了一个新的酶放大系统。用2种免疫亲和树脂，在色谱过程中形成酶1－抗体－抗原－酶2复合物两种酶的联级放大作用使检测灵敏度大大提高，该方法测定人生长激素的检出限低于10－15mol。另外，在以NAD+／NADH循环为基础的酶放大系统中，加入氨基脲试剂可以增加NAD／NADH的循环，使该放大系统的灵敏度进一步提高(J．L．Brooks，1991)。在不增加设备条件的情况下，改变传统ELISA的操作程序也可以提高灵敏度。W．L．Naser等(1990)介绍的SIMIT技术，利用抗体和抗－抗体能形成多层复合物的特性，将预先混合好的抗体、抗抗体酶一步加入到包被好的微孔板中，经保温洗涤后即可测定结果。该方法可以使ELISA的检测水平提高10～20倍。如果和振摇－保温系统(R．E．Mushens等，1990)结合，还可以大大减化ELISA的操作步骤，缩短检测时间，因此很有实用价值。ELISA中可发生多种非特异吸附作用，但主要的非特异反应是由于抗体反应体系选择不当所致，不合适的抗体反应体系(如大鼠抗体和小鼠抗体反应系统)引起的非特异反应可导致ELISA出现假阳性结果，选择适当的抗体组合(如羊IgG和兔lgG反应系统)可明显地减少这种非特异反应的发生。实际工作中通常采用一些简单的预处理方法，如用固定化的抗生物素蛋白预先处理抗血清，去除抗体和抗生物素蛋白间的非特异作用：用小鼠的非特异免疫球蛋白预处理血清，减弱其它抗体和小鼠抗体(单克隆抗体)的非特异结合，避免这种非特异反应的发生，在设计一个具体的ELISA检测系统时，还应考虑不同封闭蛋白的封闭效果、实验用水的纯度(F．H．Pruslin等．1991)、缓冲液的种类及实验中的某些处理步骤等一些细节的影响。总之，设计特殊的实验方法检测特定物质是ELISA试验的发展方向。开发新的免疫试剂，提高免疫试剂的质量，是提高ELISA特异性的另一途径。高选择性的单克隆抗体的应用明显地改善了抗体和异质抗原间的交叉反应，筛选高选择性的单克隆抗体技术已经很成熟。目前已能筛选构象特异性单克隆抗体(W．Pfund等，1990)，单克隆抗体将逐步取代多克隆抗体(血清)在ELISA中的应用。新开发的细胞IgG结合蛋白H已在E．coli中克隆并表现。蛋白H可选择性地和人lgG结合，但没有发现能与lgM， lgA和lgE结合。它的另一突出的特点是和牛lgG没有交叉反应，从而避免在细胞培养物检测时由牛血清带来的干扰，因而是一个非常有价值的免疫试剂。ELISA和其它分析技术的结合，不仅可区分异质抗原间的交叉反应，而且已发展成专门的分析方法，如和电泳技术的融合——免疫印染技术；和层析技术的融合－层析ELISA技术。前者利用电泳技术分离混合抗原，后者通常应用层析技术分离混合半抗原。免疫印染技术已相当成熟，Harper等对此已有详细的综述。K．g．Mann等(1990)报道了一个称之为特异活性部位免疫测定法，该方法利用酶(抗原)对底物的特异性、抗体对抗原(酶)的特异性为双重识别，大大提高检测的专属性，对酶(受体)类抗原的测定提供了新的方法。ELISA可用于含量分析，测定时微孔板上同时设有标准样品和待测样品，测试结果的准确性与待测样品的重复数有关。增大待测样品和标准样品的重复数，可提高测定结果的准确率。但同时也减少一块微孔板上能测定的样品数目。D．S．Bunch等(1990)利用统计学原理，对测试中待测样品和标准样品在96孔微孔板上的配置引起的误差情况进行分析，实验中可以根据各自的实验误差要求选择最佳配置。根据F．H．Pruslin等(1991)的建议，在含量分析中还应特别留意实验空白值的合理性及作为二抗的抗体酶用量是否合适，以提高测定结果的精确性。ELISA实验设计的另一研究焦点集中在对抗体亲和力的测定上。ELISA可以方便地测定抗原－抗体复合物的解离常数(Kd)，尤其当抗体的亲和力较低，其它方法不易测定时，ELISA更显出其优越性。亲和力测定的ELISA方法以Friguer法较为成熟。最近的研究资料表明，如抗原中抗原决定簇的密度对亲和力测定的影响(G．P．Holland等，1991)；包被抗原对液相中抗原－抗体反应的影响(S．Hetherington，1990)等，已促使Friguet法更加完善，ELISA测定的亲和力结果已经接近真值。在完善经典测定方法的同时，也有人试图采用新的途径测定亲和力。M．F．Hoylaerts等(1990)利用类似于在二底物酶动力学研究中应用的数学处理方法，在液相中有抗体存在的情况下分析溶液中抗原和包被抗体的结合作用，反应强度和液相中抗体浓度的双倒数曲线呈直线，由不同包被量抗体得出的一组直线的交点即为Kd。该方法的主要问题是低浓度情况下常带来试验误差，这种偏差在双倒数做图时又被放大，因此影响对Kd值的精确测定。V．Chapman等(1990)对液相中抗体和固相抗原的结合作用进行了分析，结果表明这种结合服从Langmurian等温方程，因此被称为Langmurian吸附。用Langmurian吸附理论可以很好地解释竞争ELISA的试验结果。几项ELISA应用研究很值得一提，W．Pfund等(1990)建立的构象敏感性免疫测定法可用于鉴定构象特异性单克隆抗体，其基本原理为利用变性技术使包被蛋白(抗原)变性，然后利用传统的ELISA比较单克隆抗体和变性蛋白及正常蛋白的作用情况，当单克隆抗体仅能与正常蛋白作用而不能与变性蛋白作用，或仅能与变性蛋白作用而不能与正常蛋白作用时，该单克隆抗体为构象特异性抗体。H．Inagaki等(1990)利用该原理发展了一个对转移生长因子a(TGFa)的非常特异的分析方法，在三明治ELISA中，利用包被的免抗TGFa抗体吸附样品中的TGFa，并使吸附后的TGFa构象改变，此时原先不外露在TGFa表面的10～33位氨基酸序列外露，利用筛选到的位于该位点结合的单克隆抗体与之作用，从而解决了TGFa的表皮生长因子(EGF)间的交叉反应问题。另一项用于改进淋巴细胞转化试验的ELISA方法(P．L．T．Huong等，1991)是利用制备的5－溴脱氧尿苷(BrdUrd)抗体，检测细胞复制过程中Brd Urd的渗入量，进而测定经抗原处理的淋巴细胞的增殖情况，检测结果与传统的利用H3－Tdr的测定结果相同，但由于所用的设备条件简单，因此使用起来更为方便。ELISA技术的发展主要表现为完善和改进已有的测定方法，发展新的测定方法，使测定结果更灵敏、准确，使用范围更广泛。对新型免疫试剂的开发研究，尤其是利用基因工程、蛋白质工程开发出的超高效免疫试剂，如已开发的既有酶活性又能和抗体结合的变苯儿酚酶／蛋白A融合蛋白，将使ELISA应用起来更加方便、可靠，这将是发展的主要方向。(中国药品生物制品检定所胡昌勤副研究员撰) |
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