| 单词 | 甜菜生物工程 |
| 释义 | 【甜菜生物工程】 组织、器官培养 甜菜组织器官培养主要包括茎、叶、根、花器官、种子及未成熟胚培养等。组织培养技术对于甜菜优良基因型的快速繁殖及种质保存，获得高糖、耐盐碱、抗除草剂体细胞无性系，克服远缘杂交中的杂种胚育或萌发困难、次生产物生产，以及遗传转化研究等，都具有重要的实用价值。 自1970年马加拉(J．M．Margara)首次报道甜菜花芽离体培养诱导形成不定芽以来，甜菜组织培养的研究领域迅速拓宽。据报道，甜菜的苗端分生组织、子叶、下胚轴、叶、叶柄、根、花蕾、花枝、花穗(花序)、未成熟胚等离体培养都获得再生植株。其它如组织培养中的激素驯化、体细胞克隆变异及种质保存等方面，都取得了长足的进展。甜菜再生植株一般以不定芽或腋芽的方式发生。从叶柄和叶外植体离体培养可以产生腋芽或不定芽。植株再生的难易一般取决于外植体部位和供体植株的基因型。从苗端、花芽和花序切段生植株似乎是更为有利，与其它部位的组织相比，这些部位的组织具有较高的遗传稳定性和形态发生潜力。．用于甜菜组织培养的培养基主要有MS、PGOB、B5等。1988年，弗雷塔格(A．H．Fretyag)等将MS培养基中的肌醇去掉，另外增加7种维生素和6种氨基酸组成RV培养基。甜菜苗端、下胚轴、子叶、叶片、叶柄、根、花芽、花枝、胚等外植体离体培养研究结果表明：以MS、PGOB、B5等基本培养基附加适量2，4－D和KT或BA、IAA和BA或KT、NAA和BA，或单独附加BA或NAA，均可诱导形成愈伤组织。分化培养基主要去掉2，4－D，相应提高细胞分裂素浓度，利用生长素(或抗生长素)的不同组合，如KT加NAA或GA、BA加IBA、TIBA加ZEA，或单独附加NAA、BA、GA等，均可诱导愈伤组织分化。1987年，特图(T．Tetu)等对不同外植体的愈伤组织进行形态发生能力的实验的结果表明甜菜愈伤组织存在3种主要形态发生途径，即根、苗形成和体细胞胚胎发生。生长激素决定愈伤组织的形态发生潜力。生长素诱导根的形成，NAA和6BA组合诱导愈伤组织偶尔形成芽(最高为12%)，TIBA和6BA或ZEA组合诱导愈伤组织强烈形成芽(最高为52%)。复合激素序列诱导体细胞胚胎发生。一般认为甜菜愈伤组织的形态发生主要取决于外源生长素 细胞分裂素的比例、基因型、内源激素水平和基本培养基等。但到目前为止，离体培养研究资料证明，甜菜仍属形态发生困难的种，特别是有关细胞胚胎发生途径的研究尚待深入进行。甜菜组织培养技术有助于建立一个筛选抗病、高糖、耐盐碱、抗除草剂突变体的快速有效的实验体系。利用发根农杆菌转化的甜菜培养物可以产生次生物质(甜菜苷类色素)。探求实用的、有效的再生系统进行转基因的研究也是一个正在开发的领域。花药、胚珠、子房培养 甜菜花药、胚珠和子房培养是获得纯合二倍体的有效手段。该技术与常规育种技术相结合，能加速杂种性状的稳定，缩短育种年限，提高选择效率，同时也能分离出新的甜菜生物型。1972年，斑巴(H．Banba)等最先开始甜菜花药培养诱导单倍体工作，但仅得到二倍体小植株。中国科技工作者在甜菜花药培养单倍体诱导研究领域首次获得成功。1973年，王宇清等获得四倍体甜菜的双单倍体植株。1979年，邵明文报道获得甜菜单倍体植株。1983年，霍斯曼斯(D．Hosemans)等通过甜菜未授粉胚珠培养首次获得单倍体植株。1987年，范盖特(J．Van Geyt)待认为利用胚珠或子房培养都能获得单倍体，子房培养经胚球培养更为成功。甜菜花药培养形成单倍体植株的影响因子主要为基因型、花粉发育时期、培养基及供体植株的生理状态等。一般认为花药接种的最适宜时期为单核中晚期。愈伤组织诱导培养基以MS+2，4－D 2．0mg／L+KT 0．5mg／L，或MS+2，4－D 2．0+IAA 1．0mg／L+GA 1．0mg／L+KT 0．5mg／L培养效果较好。由于材料的遗传类型不同，分化能力差异很大。分化培养基以MS+KT 3．0mg／L+IAA 0．5mg／L或+6BA 1．5mg／L+IAA 0．5mg／L+谷氨酰胺200mg／L+丝氨酸2．0mg／L+腺嘌呤40mg／L效果较好。1979年，邵明文发现甜菜花粉植株的形成有3种方式：(1)由愈伤组织分化成植株；(2)由愈伤组织先形成胚状体，再由胚状体发育成植株；(3)花粉不经过愈伤组织阶段，直接形成胚状体，然后再由胚状体发育成植株。目前从甜菜花粉植株后代中已初步鉴定出高糖纯合品系，其块根产量、含糖率、产糖量均高于对照。研究表明，通过花药培养可以分离出高度纯合的甜菜新生物型。胚珠培养易于产生单倍体。一般认为胚囊发育至成熟阶段的胚珠诱导效果较佳。胚珠培养结果一般先形成胚状体，再由胚状体发育成植株。1985年，霍斯曼斯认为单倍体的胚状体起源于卵细胞或反足细胞。胚状体诱导培养基以MS+NAA 0．1mg／L+6BA l．5mg／L，或+IAA 0．5mg／L+KT 2．0mg／L培养效果较好。除培养基外，胚状体的诱导频率还受材料基因型的遗传控制。1987年，邵明文等对胚珠植株后代进行遗传性状观察，发现H0代胚珠植株形态特征有多样性；但胚珠H1代植株与亲本相比，表现出高度纯合性，它们的株型、下胚轴颜色、根形等性状表现整齐一致。具有特殊意义的是H1代胚珠植株其含糖率明显较高，单株间含糖率的标准差和变异系数均比亲本小。甜菜子房培养所用培养基与胚珠基本相同。子房培养的主要优点是其发育状况与胚球培养相比显得不大重要。利用幼嫩子房培养时，不可能受精，这样对雄性不育和雄性可育植株都可进行研究。1985年，博斯奥特罗特(D．Bossoutrot)等提出在继代培养基中直接加秋水仙碱(100毫克／升)的加倍方法。1991年，牛维和等提出液体振荡培养加倍技术。还有用0．2%～0．3%秋水仙碱液直接滴注幼苗生长等加倍方法。但在实际加倍过程中易产生嵌合体和非整倍体，从而导致植株后代结实率低。关于甜菜单倍体植株染色体加倍技术的研究尚有待完善。甜菜胚珠培养已成为甜菜获得纯合系最有效方法。通过大量纯系的配合力测定，可以快速选育出强优势组合。预示纯合系配成的杂种具有更高的产量、含糖率、生活力和群体整齐度。有人将胚珠培养作为一个良好的甜菜再生系统已用于抗病突变体的筛选工作。胚珠培养与外源DNA导入技术相结合可能会成为甜菜转基因的一条简便途径。原生质体培养与细胞融合 原生质体技术，特别是有关体细胞杂交和基因或细胞质转移技术对甜菜育种将是有益的。原生质体技术可能成为甜菜遗传工程技术发展的决定步骤。1976年，李氏等首先进行甜菜叶肉原生质体分离和培养。1981年，斯莫伦斯卡娅(I．N．Smolenskaya)进行悬浮细胞的原生质体分离和培养，结果仅得到8～10细胞的细胞团。近10年，来，甜菜原生质体成株技术已日渐成熟，许多人已得到原生质体再生愈伤组织。1990年，李兴峰等进行甜菜原生质体培养，结果直接得到体细胞胚。1990年，克伦斯(F．A．Krens)等得到叶肉细胞的原生质体再生植株。1988年，霍尔(R．D．Hall)等首次利用电融合得到甜菜胞质杂种。甜菜用于分离原生质体的材料主要有叶外植体、愈伤组织和悬浮细胞系等。实验资料表明，用于分离原生质体起始材料的取材时间对原生质体的产量和质量影响很大。一般用转代培养8～10d的愈伤组织，培养后2～5d的悬浮细胞，或用苗龄6～8周实生苗的真叶为佳。为了得到产量高、质量好的原生质体，酶的组合与浓度配比及渗透压稳定剂的种类及浓度的选择也是重要的。一般认为适于甜菜原生质体分离的混合酶液如下：1%～2%(W／V)cellulase onozuka RS(或cellu-lase onozuka R－10)，0．5%～1．5% Macerozyme R－10(或0．05%～0．1%pectolyase Y－23)，0．5%～1．0% Drlselase(或0．05%～0．1%脱盐Drlselase)。有些人在酶液中还加入葡聚糖硫酸钾及牛血清蛋白等。1990年，李兴峰等认为在用愈伤组织分离原生质体时，在酶液中增加蜗牛酶是至关重要的。推测甜菜愈具备组织细胞壁中可能含有1．3－糖苷键。多数人用甘露醇作渗透稳定剂。1987年，米勒(B．Muller)等认为用KCL代替甘露醇作渗透稳定剂能够原生质体的得率，但并不影响原生质体的生活力。甜菜原生质体培养基可采用MS、B5、PGOB或KM8P等，其中无机盐浓度可降低一半。培养基中渗透稳定剂和碳源一般使用蔗糖(0．3～0．4mol)或葡萄糖(0．4mo1)，或两者结合使用，也可再和糖醇结合使用。减少培养基中无机氮增加有机氮，对原生质体成活、再生和分裂是有利的。在原生质体培养中，为诱导细胞持续分裂，一般都需要加入外源生长素和细胞分裂素。1985年，巴特(S．R．Bhat)等指出：对于PGOB、MS和B5基本培养基而言，2，4－D和6BA的最适浓度分别为1．0mg／L和0．5mg／L。在此浓度下约11%细胞表现出有丝分裂活性，10d内细胞增殖形成克隆。而KM8P培养基的最适激素浓度为NAA1．0mg／L、2，4－D 0．2～0．5mg／L和6BA 0．25mg／L．。原生质体植板率受基因型、培养基和原生质体分离中所用的酶所制约。KM8P培养基优于B5和PGOB培养基，后者的植板率接近相等。1985年，萨巴道斯(L．Szabados)和1986年，巴特等认为利用10%～20%的条件培养基或饲喂培养系统能明显地促进原生质体分裂并导致克隆形成。1990年，克伦斯提出培养基中没食子酸正丙酯(脂肪氧合酶抑制剂)的存在能够保持叶肉原生质体持续分裂。甜菜原生质体培养采用液体浅层培养和固体培养或饲喂培养系统均能取得较好培养效果。因甜菜原生质体成株技术尚不完善，有关细胞融合的研究刚刚起步。1988年，霍尔利用电融合方法得到甜菜胞质杂种。实验资料表明，以甘露醇和蔗糖非等渗层为基础的方法对甜菜生产胞质体是适宜的。电融合并加入不同盐溶液表明对甜菜的异核体的存活率要比化学诱导融合法高。甜菜原生质体是基因转化的理想受体系统。有人利用电击法和超声波法已将CAT基因导入甜菜原生质体，并得到瞬时表达，这是一个良好的开端。随着原生质体技术日趋完善和原生质体再生植株基因型不断的增加，通过导入有经济价值的抗病基因和抗虫基因，以获得具有更优良经济性状的甜菜新品系，已为期不远。通过体细胞杂交使有益基因在甜菜野生种和栽培种间实现转移，将会创造出甜菜新类型。应用胞质融合技术能够将细胞质编码性状随意迅速转移到任何所选品系中，而不改变其核遗传成分，对甜菜育种工作者将是极有益的。甜菜叶绿体基因组 甜菜叶绿体基因组也叫叶绿体DNA(简称ctDNA)。甜菜ctDNA结构组成，限制性内切酶图谱构建及基因定位研究等，对于在分子水平上阐明叶绿体的遗传特性，分析Beta属内种间分类学和进化的关系等具有重要意义。甜菜叶绿体基因组的研究最早见于1975年，赫尔曼(R．G．Herrman)的报道。1983年，鲍林(A．Powling)等用限制性内切酶SaIGI、BamHI和PstI水解细胞质雄不育和可育甜菜的ctDNA，发现两类细胞质型甜菜间ctDNA的限制性内切酶水解片段没有差异，仅在用EcoRI水解的情况下，两细胞质型间存在一个水解片段的差异。这和线粒体DNA的情况明显不同。邵明文认为，细胞质雄不育性是由mtDNA编码，而不是由ctDNA编码。近年，来，许多人对ctDNA的结构的多样性和变异性进行了研究，同时也构建了ctDNA的限制性内切酶图谱。1989年，柳井(Y．Yanal)进一步对甜菜ctDNA的结构组成及其转录活性进行了研究。甜菜ctDNA是超卷曲的双线环状DNA。1975年，赫尔曼等研究菜ctDNA的浮力密度为1．697g／cm3分子周长为44．9±1．7μm。根据用不同限制性内切酶水解ctDNA的结果，1986年，贵岛(Y．Kishima)和布里斯(T．Brears)得到甜菜ctDNA的大小分别是147．3kb和148．5kb。电镜观察结果表明，甜菜环状ctDNA的分子周长为45．3±1．5μtm。1984年，三上(T．Mikami)用限制性内切酶方法得到甜菜ctDNA分子量97×106。甜菜ctDNA限制性内切酶图谱的构建主要使用两种方法，即单酶、双酶消化法和重叠科斯质粒克隆法。在构建ctDNA内切酶图谱的基础上，利用异体探针与ctDNA内切酶片段的杂交，或者利用内切酶片段克隆化后体外转录、翻译合成蛋白质就能为叶绿体基因定位。1986年，贵岛用烟草23s和16srRNA作为甜菜ctDNA基因定位的探针，与甜菜ctDNA的限制内切酶片段杂交，确定了甜菜ctDNA23s和16srRNA的基因位于反向重复序列上。用同法确定了1．5－二磷酸核酮糖的大亚基因位于反向重复序列之外的大的单拷贝区上。1986年，布里斯用异体探针与ctDNA片段杂交得到与贵岛相同的结果。用来自小麦的探针，确定了甜菜ctDNA编码光系统Ⅱ反应中心的32KD蛋白质的基因是位于重复序列之外但与重复序列相邻的区域。1986年，三上用烟草叶绿体rRNA作探针，还确定了30s核糖体蛋白质19(tps19)、NADH脱氢酶亚基ND1(ndhA)、ND2(ndhB)、ND3(ndhc)、ND4(ndhD)、ND4L(ndhE)、NK5(ndhF)等基因在图谱上的位置。甜菜ctDNA基因组在其进化过程中具有高度保守的特性，但甜菜属植物叶绿体基因组分子结构依然存在着种间的或种内的变异。叶绿体基因组合多型性在研究甜菜种间亲缘关系及系统发生方面有重要的实用价值。值的注意是，甜菜ctDNA的限制性内切酶分析和叶绿体编码的部位Ⅰ蛋白质大亚单位的等电聚焦电泳分析结果二者显示密切相关。利用限制性内切酶分析ctDNA，为研究甜菜物种间系统发育提供了一个精细便利的方法。1984年，三上认为关系密切的物种间DNA消化图谱极基相似，而关系较远的物种间则显示出某种差异。叶绿体DNA酶解模式亲缘关系的程度可以反映Beta属内种间分类学和进化的关系。甜菜叶绿体遗传、叶绿体DNA在遗传中的地位以及所涉及的叶绿体基因组的结构与性状是一个远未解决的问题。甜菜ctDNA文库有待构建，ctDNA序列分析也有待进行，明确甜菜属种间叶绿体基因组变异和进化机制将是一个有意义的课题。甜菜线粒体基因组 甜菜是重要糖料作物之一，开展线粒体基因组的基因定位、基因序列分析、基因重组及遗传特性的研究，对于发展新的育种选择技术，培养具有优良品质特性的品种能起重要作用。关于甜菜线粒体DNA(简称mtDNA)的研究工作始见于1981年，鲍林(A．Powling)的报道，他首次以甜菜为材料提取线粒体DNA，用凝胶电泳法证实，在甜菜线粒体中存在两类DNA分子，一类被称为高分子量DNA(简称HMW DNA)，另一类是低分子量DNA(简称LMWDNA)，二者分子量大小差异比较明显。后来的实验资料证明这一研究结果是正确的。10年，来，随着分子生物学技术的不断发展，甜菜线粒体基因组的有关问题，如基因组结构、基因序列分析、基因定位及其与细胞质雄可育／不育性相关性等方面都得到较深入的研究，并取得一些研究成果。甜菜线粒体基因组大小约为360～400kb。根据1988年，布里斯(T．Brears)的研究结果，甜菜线粒体基因组是由一些环状mtDNA分子组成的，其中有一个主环分子，其大小为386．31kb，它有5个重复序列，这些重复序列具有非常活跃的分子内重组性，因而通过这种重组、在线粒体产生出其它的分子量不等的环状分子，但它们的序列与主环分子的序列是同质的。因此，线粒体中一个主环分子DNA含有基因组的所有遗传信息。这一研究结果得到其它实验资料的支持。甜菜线粒体中存在低分子量DNA分子是一个引人注意的发现。多数研究结果表明，甜菜线粒体中存在着1～5条小分子量环状DNA分子，它们的大小分别为1．63、1．5、1．45、1．4、和1．3kb。在不同的细胞质来源的甜菜品系中存在着特定的小环状分子的不同组合。因此这些小分子环状DNA可能与甜菜的细胞质不育／可育性相关。1989年，索米托－拉普拉德(P．SaumitouLaprade)认为甜菜线粒体基因组中存在线性DNA分子量，使构建线粒体DNA物理图谱的工作较叶绿体DNA物理图谱的构建要复杂得多。有不少学者用多种限制性内切酶包括BamHI、EcoRI、Hink Ⅲ、Bag Ⅰ等水解纯化的mtDNA，得到一些初步结果，但未能得到完整的物理图谱。1988年，布里斯等用粘性末端质粒克隆重叠技术成功地确定了XhoⅠ、SamⅠ两种限制性内切酶水解甜菜mtDNA的物理图谱。尽管甜菜线粒体基因组的基因定位工作做得不是很多，但也有10余基因已被定位，包括cox Ⅰ、cox Ⅱ、cox Ⅲ、atpA、atp6、Atp9、cyb26sRNA等。其中细胞色素氧化酶的第1个亚基cox Ⅰ研究得比较清楚，它位于242．25～245．48kb的位置上。根据1987年，原田(T．Harada)等的序列分析，此基因是含有1584个核苷酸对的连续开放读码序列，其释放产物是516个氨基酸的多肽。另外一个有趣的现象是，在线粒体基因组上编码部分叶绿体基因16sRNA。这种现象在其它植物上也有发现，然而对这种基因转移的机理仍不清楚。1988年，霍尔顿(C．Hallden)和1989年，曼(V．Mann)从野生甜菜中得到了新的细胞质不育甜菜品系，它们的mtDNA与其保持系和其它Owen细胞质雄不育品系的mtDNA不同，表现在mtDNA的内切酶水解片段上存在差异。甜菜线粒体基因组与细胞质雄可育／不育性密切相关，有人已着手利用分析mtDNA手段从甜菜远缘杂交的后代中鉴定、筛选新的细胞质雄不育甜菜品系，这有可能发展出新的育种选择技术，即用探针技术在早期对甜菜进行细胞质来源的鉴定。这种精确的选择方法必将在甜菜育种中发挥重要作用。另外，研究线粒体基因组的定位，是一个非常重要的工作，它是今后开展甜菜遗传工程的基础，因此这方面的研究工作将会得到更快的发展。基因工程 植物基因工程技术显示了常规育种技术无法比拟的优越性。甜菜属二年，生作物，其品种的改良是一个缓慢的过程，选育一个新品种往往要花费十几年，时间，而基因工程技术一开始就在单个目的基因水平上操作，基因的分离、重组、转化、表达都是在既定的实验程序中进行，它在快速定向育种方面有极大的潜力。关于甜菜基因工程研究工作始见于1984年，蒋兴邨等的报道。他们首次用致瘤农杆菌感染甜菜的下胚轴，通过对致瘤组织的章鱼碱的胭脂脱氢酶(NPDH)的测定，证明T-DNA在甜菜基因组中能够转移和表达。近年，来，甜菜基因工程研究进展十分迅速。在抗除草剂、抗丛根病和抗病毒方面都已得到甜菜转基因植株，其中抗丝根病基因工程甜菜已进入大田实验。其它如有关基因转移方法、抗线虫基因的分离、探针及强启动子的构建等方面都取得新的进展。1987年，林赛(K．Lindsey)等把CAT基因通过电激基因转移不仅导入甜菜原生质体，同时也导入甜菜悬浮细胞并得到瞬间表达。1990年，乔尔斯伯(M．Joersbo)把CAT基因通过超声波基因转移法也成功地导入甜菜原生质体并得到瞬间表达。1990年，林赛用甜菜幼苗基部的组织与农杆菌(含有双元载体PBin 19CAT携带有CAT和NPT－Ⅱ基因)或pB1121(携带有GUS和NPT－Ⅱ基因)共培养转化甜菜，得到转化的再生植株。1990年，卡勒霍夫(J．kallehoff)用甜菜悬浮细胞与农杆菌(含携带BNYVV外壳蛋白基因的双元载体)共培养，得到转化的甜菜细胞，用转化的细胞分离原生质体，然后对原生质体用BNYVV进行感染，结果表明外壳蛋白基因在甜菜原生质体中得到表达。比利时里曼斯(J．Leemans)等把从链霉菌中分离的一种编码抗除草剂(膦基酮)的基因导入甜菜，结果得到高度抗除草剂的转基因甜菜植株。这种甜菜植株含有一种酶，它能测出膦基除草剂并把它转化为无害的分子。温室试验表明，这种甜菜经膦基除草剂喷洒后生长正常。丹麦马里博(Maribo)甜菜种子公司的研究人员利用Ti质粒作载体，已成功地将BNYVV外壳蛋白基因导入甜菜，获得抗丛根病病毒的转基因甜菜植株。目前已构建一系列对利用甜菜组织转化有用的表达载体。这些结构是来自Ti质粒的双元载体系统，具有专一性启动子(CMV的P35S)、选择标记基因(卡那霉素)和来自BNYVVRNA－2的外壳蛋白基因。另外，该公司还得到抗除草剂的转基因甜菜植株，该种甜菜带有编码抗除草剂(镇草宁)的EPSPS基因。丹麦议会已经批准试种基因工程甜菜，试种面积为5000m2。1991年，陈章良报道他的实验室也得到了抗病毒的甜菜转基因植株。甜菜基因工程技术研究中的首批成果已经接近或初步进入开发利用的阶段。但也不能忽视研究中尚存在的新问题，如外源基因在转基因甜菜品系、品种中遗传稳定性如何，转基因甜菜是否会造成农业污染等问题，都需要研究。甜菜抗虫基因工程的研究将提供一条新的诱人途径。用基因工程方法，可以将苏云金杆菌的杀虫毒素基因转移到甜菜植物体内，使甜菜产生抗虫性，同时不会造成严重的环境污染。另外，有人已从野生甜菜中分离出抗线虫基因，近期有可能获得抗线虫转基因甜菜植株。预计20世纪末，通过基因工程方法培养的抗病毒、抗除草剂和抗虫甜菜品种在甜菜生产上将得到广泛推广应用。【参考文献】：1 Li Su-nam．Biologia plantarum(Praha)．1976，18(5)：389～3922 Laszlo Szabodos，Carina Gaggero，Plant Cell Reports，1985，4：195～1983 Bhat S R，Ford-Loyd B V，Callow J A．Plant Cell Reports，1985，(6)：345～3504 Shao Ming-wen，Doney D L．Sugarbeet Research and Extension Reports．1986，175～1805 张悦琴，等．中国甜菜，1986，3：9～136 邵明文，等．中国甜菜，1988，2：4～12(中国农业科学院甜菜研究所邵明文副研究员撰；张悦琴审) |
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