| 单词 | 植物原生质体培养和融合在育种上应用 |
| 释义 | 【植物原生质体培养和融合在育种上应用】 拼译：applications of protoplast culture and fusion in crop genetic improvement 60年代开始发展起来的植物原生质体培养和融合(即体细胞杂交)技术经历30多年的艰苦曲折的道路，现在这项技术已逐步完善和成熟，开始显示它在作物改良上的重要作用。它可克服常规育种上的某些局限性，扩大植物的变异范围和创造新种、增加新品种的选择效果。如通过原生质体融合可以获得远缘杂种植株，不仅克服了远缘种杂交不亲和性，而且可以创造新种和从中选择到优良品种；通过原生质体融合还可转移作物杂交育种上有重要价值的细胞质雄性不育基因，迅速选育出期望的雄性不育系；原生质体无细胞壁，可以直接摄取外源DNA、细胞器，所以它又是遗传转化研究的一个十分理想的受体，从而可有目的地引入特定的有用基因，改良作物的产量、品质和抗逆性等；在原生质体培养过程中，往往会产生体细胞无性系变异，同时原生质体可通过理化因子诱变得到有用变异体，从中可选择到新种质；原生质体还可用于作物优良种质的超低温保存。 原生质体培养及其育种要求 植物原生质体再生成株的技术是原生质体培养技术应用于作物改良的基本前提和关键环节，这项技术包括从植物外植体游离出大量原生质体，经培养再生成细胞团，直至分化成大量完整而可育植株。自1971年Takebe等首次从烟草叶肉原生质体再生成植株以来，植物原生质体培养获得了巨大进展。据不完全统计，已有200余种植物的原生质体培养获得成功。特别是禾谷类，食用豆类的重要种的原生质体培养都已获得成功，以及一些木本植物也成功地获得了原生质体再生植株。为利用原生质体的遗传操作改良作物打下了坚实的技术基础。10年前国际上普遍认为很难成功的禾谷类、豆科和棉花的原生质体培养在近10年有了突飞猛进的发展。根据各个实验室介绍的经验看，取得这些成就是长期研究实践积累了经验，改善和提高培养技术的基础上取得的。特别是采用了分生能力强的幼胚、子叶、下胚轴以及悬浮细胞系作为游离原生质体的材料；使用PectolyaseY23(果胶酶)并缩短游离时间；以及广泛采用琼脂糖包埋和饲养培养技术。这些技术的改良和采用是禾谷类和其它难培养植物原生质体培养成功的关键，当然也不否定其它方法的改进所带来的作用。虽然植物原生质体培养的成就令人鼓舞，但从作物育种来看，这项技术尚难满足育种要求，存在着有待重视和解决的问题：(1)目前虽有约20余种植物原生质体培养获得成功，但仍有许多重要的或有应用潜力的植物原生质体培养尚未成功，如茶树、橡胶、桃、梨和麻类等。(2)原生质体培养已成功的植物尚存在稳定性和重复性差，效率低和基因型障碍。(3)目前难成功的植物种(禾本科和豆科)，在原生质体培养中，往往都采用从悬浮细胞游离原生质体，这一培养体系虽有易培养成功的优点，但应用于育种时，则存在着建立胚性细胞悬游系较困难和易发生遗传变异，不太适于作为遗传操作的供体。因此应加强这些作物的器官(如叶、茎)原生质体培养体系的研究。印度Gupta等(1993)已从水稻叶原生质体培养获得再生植株。(4)从事原生质体培养的基础技术研究者同育种实践的研究者之间脱节，需要加强联系和合作，以便按育种要求完善技术体系。原生质体融合研究 自Carlson等在1972年获得第1株烟草体细胞杂种植株以来，细胞融合技术在不断完善和发展，获得融合杂种植株的植物种在不断增加。1．原生质体融合的杂种植物 尽管许多研究者怀着良好的愿望进行种内、种间、属间、科间甚至更远缘的原生质体融合研究，但获得真正杂种植株的事例仍不多。(1)在茄属中已获得融合杂种植株有：马铃薯(2×)+马铃薯(2×)，马铃薯(2×)+S．brevidens(2×)，马铃薯(4×)+S．brevidens(2×)，马铃薯(4×)+S．bulbocastanum，马铃薯+S．phureja(2×)，马铃薯+番茄、马铃薯+龙葵、马铃薯+醋栗番茄、马铃薯+烟草、马铃薯+黑茄、番茄+Solanum pennellii等。(2)在烟草属中已获得融合杂种植株有：粉蓝烟草+郎氏烟草，烟草+黄花烟草、烟草+花烟草、烟草+N．nesophila、烟草+粉蓝烟草等。(3)芸薹属中已获得融合杂种植株有：拟南芥油菜(拟南芥菜+白菜型油菜)，甘蓝油菜(甘蓝+白菜)、甘蓝+白菜型油菜，白菜型油菜+花椰菜等。胞质杂种有：polia(MS)油菜+抗除草剂油菜，具正常叶绿体基因组油菜+带有萝卜胞质油菜雄性不育系等。(4)柑桔属中已取得脐橙同温州密桔、脐橙同葡萄柚，甜橙同枳、哈姆林甜橙同飞龙枳，哈姆林甜橙同两列蠔壳刺等10余个种间和属间的体细胞杂种植株。其中哈姆林甜橙同两列蠔壳刺杂种是有性不亲和的木本植物属间产生体细胞杂种的第一个实例。(5)在豆科中有苜蓿+野苜蓿(6)在禾谷类有：水稻+水稻，粳稻+籼稻，栽培稻+野生稻(4个种)，以及水稻+稻稗。(6)在禾谷类中有：水稻+水稻，粳稻+籼稻，栽培稻+野生稻(4个种)，以及水稻+稻稗。2．原生质体融合技术的发展 20余年来，虽然植物原生质体融合成株有了较大进展，但这期间研究主要还是围绕着原生质体融合技术程序的建立和完善，这套技术程序，主要包括3个环节：诱导原生质体融合，杂种细胞筛选，杂种植株的再生和鉴定。(1)融合方法。高国楠(1974)建立的PEG法经过不断改进，已逐步走向完善，并得到广泛的应用。其融合频率可达10%～15%，它无种属特异性，几乎可诱导任何原生质体间融合。在应用PEG进行融合时，重要的影响因素是PEG的种类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度。近年一些研究者建议在PEG溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白，15%二甲基亚砜，链霉素蛋合酶等)，可以有效地提高原生质体融合频率。孙蒙祥等(1994)报道，用PEG诱导选定的成对原生质体间的融合，从而使PEG融合技术更精确化，并有可能免除杂种细胞筛选。电融合法发展迅速，是目前最流行的融合方法，它是1979年由Senda建立的，进一步为Zimmermann等(1981)所完善。电融合法有两个步骤：(1)原生质体悬浮液在两电极间施加高频交流电场(一般为0．4～1．5MHz，100～250V／cm)，使原生质体偶极化而沿电场线方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链。(2)再用一次或多次瞬间高压直流电脉冲(一般为3×10μsel，1～3kV／cm)来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。Schweiger(1987)把电融合法与微培养法结合，建立了单对原生质体融合技术程序，这是近年来融合技术上取得的最突出的成就。它不仅改进了融合方法，而且是两亲本间的原生质体一对一融合，有可能解决融合细胞的选择问题，这是一种非常有前途的技术体系。其方法是将两个异源原生质体转移到微滴融合液中，用直径为50μm的白金电极在倒置显微镜下进行融合操作，待融合后将融合的异核体移到微滴培养液中培养，再生成杂种植株。目前正在研究用电脑控制进行自动化操作，提高操作工作效率。(2)杂种细胞筛选目前仍采用3种方法：突变细胞互补选择法，根据原生质体特性差异的机械选择法，根据杂种细胞生长差异的选择法。第一种方法往往需要建立和保持亲本突变细胞系，在实际应用上受一定限制也不易取材，采用者在减少。其它两种方法也只能根据亲本的情况而定。因此，研究出一个简便的筛选方法是十分重要的。(3)体细胞杂种植株的鉴定除采用形态学、细胞学(染色体)和同工酶技术外，近年正在发展DNA杂交及其与原位杂交技术相结合的鉴定方法，这不仅可以检测出杂种含有多少亲本的基因组成分，也可将基因定位于某个染色体上，使体细胞杂种的鉴定工作更加科学化和精确化。育种上的实际应用状况 植物原生质体由于无细胞壁，不仅是进行细胞学、遗传学、病理学、生理学等基础研究的好材料，而且也是进行作物改良的理想材料。因此，目前在广泛地采用植物原生质体培养和融合技术进行作物的品种改良时，不仅得到有价值的后代，而且还育成了一些作物新品系和新品种，开始在生产上应用和发挥优质高产的作用。1．原生质体培养技术在基因工程上的应用 由于植物原生质体是遗传转化的最理想的受体之一，用聚乙二醇、电激、脂质体、微注射法等将外源基因导入原生质体，再由转化原生质体培养成转基因植株。在我国已得到水稻、水麦、高粱、大豆、油菜、甘蓝、番茄、烟草等作物转基因植株。在我国已得到水稻、小麦、高粱、大豆、油菜、甘蓝、番茄、烟草等作物转基因植株，已经证实被导入的基因能按孟德尔遗传方式传递给子代。为获得抗病、抗虫、抗除莠剂、抗旱、抗盐、提高种子必需氨基酸及蛋白质含量等农业上有用基因的转基因批量工程植株，近年致力于建立主要农作物的基因高效转化系统。中国农业科学院将Bt毒蛋白基因转入水稻原生质体而获得抗虫水稻转基因植株并进入大田试验。2．从体细胞杂种选育新种质和新品种 通过原生质体融合能获得体细胞杂种。如果用近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的，且具双亲两套染色体的体细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种材料，从中选育新品种。如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，创造新型的物种。可见原生质体融合在克服不亲和性上有很大的潜力，并可借助原生质体融合将亲缘关系较远的一些有益性状转到现有栽培种中，从其后代选出优良品种(系)。如中国农业科学院烟草研究所自1977年开始烟草原生质体融合研究，先后获得6个组合的烟草种间体细胞杂种植株，其中N．nesophilla与普通烟草，黄花烟草与普通烟草的原生质体融合获得的杂种后代研究证明，已将N．nesophilla高抗黑胫病，高抗普通花叶病(TMV)，耐黄花叶病(CMV)的基因和黄花烟草的高尼古丁含量基因转入到普遍烟草中，以及将粉蓝烟草的抗黑胫病、叶斑病的遗传物质转入普遍烟草。黄花烟草、粉蓝烟草与普通烟草的杂种后代进行多次自交和回交，经多年观察研究，从中已选育出香气大、香气质好、耐CMV、抗黑胫病、有利用价值的新品系，正在扩大试种。Austin等(1985)用二倍体结薯的马铃薯栽培种和二倍体不结薯的野生种(S．brevidens抗卷叶病、抗寒)融合产生可育杂种植株。据测定，10个杂种植株中有9个抗马铃薯卷叶病，此外还得到了同时具有抗晚疫病和卷叶病的杂种株系。Gibzon等(1988)用双单倍体马铃薯和S．brevidons的原生质体融合获得抗马铃薯卷叶病毒(PCRV)和马铃薯Y病毒(PYV)的体细胞杂种。这表明，原生质体融合技术能够产生马铃薯不性不亲和茄属种间的体细胞杂种，并可将野生种的有益性状转移到马铃薯栽培品种，因此在马铃薯的育种实践中具有重要的应用价值。另外，在非亲和种的融合中，杂种细胞中往往出现部分或大部分染色体丢失，故只实现部分基因转移。这种杂种具有一物种的全部基因和另一物种的部分，一般称为非对称杂种，从中可选出栽培种的某一不良性状得到改良的新品种。中国农业科学院烟草研究所从普通烟草与粉蓝烟草体细胞杂交后代中选育出1个稳定株系，其形态与栽培烟草相似，但具有野生烟草的香气。3．从胞质杂种选育新品种 原生质体融合不仅包括核基因组，也涉及到核外遗传的线粒体和叶绿体的重组。如抗Atrazine和雄性不育性是分别由叶绿体和线粒体基因控制的胞质性状，原生质体融合可以使双亲的细胞质基因融合于一体，并经重组产生胞质杂种，从其后代中可选育出抗Atrazine和雄性不育材料。因此，胞质杂交是将植物的叶绿体和(或)线粒体单向转移到受体原生质体的一种有效方法。Pelletier等(1983)最先获得了具有雄性不育和抗Atrazine的油菜胞质杂种。随后，Barsby(1987)成功地获得了春油菜的胞质不育性状和冬油菜核系统组合的胞质杂种。Chuong等(1988)将单倍体油菜的原生质体融合，获得了抗Atrazine的雄性不育系，该二倍体杂种用保持系授粉时能正常结实。在水稻上，Akagi等(1989)和Yang等(1989)用原生质体融合技术获得了胞质杂种植株。Kyozuka等(1989)用X－射线处理抑制核活性的雄性不育系(供体)与用碘乙酰胺处理抑制胞质活性的受体(栽培品种：日本晴)的原生质体融合获得了含有雄性不育性状的二倍体胞质杂种，雄性不育性状被稳定地遗传到后代。若用保持系授粉，又能正常结实。这个雄性不育系胞质杂种除雄性不育性状外，其他状性基本上保持了受体(日本晴)的优良性状。Vardi等用原生质体融合获得普尔曼橙×枳(供体)+酸橙(受体)，普尔曼橙×枳(供体)+维拉费兰卡柠檬(受体)，酸橙(供体)+维拉费兰卡柠檬(受体)的胞质杂种植株，它有与受体亲本相似但不完全一致的线粒体基因组。龚明良等(1991)通过普通烟草与粉蓝烟草的原生质体融合也获得了一个胞质雄性不育系，现已转育成几个栽培品种的雄性不育系，并开始在生产上试种。这一实例说明，转育雄性不育系时，采用常规杂交方法，一般3～8年时间，而采用原生质体融合技术，将一物种的细胞质一步转向另一物种，即用不同处理钝化供体细胞核和受体的细胞质，并使之融合，这样就可在较短的时间内获得雄性不育系。4．原生质体无性系变异的利用 在组织培养过程中，往往发生体细胞无性系变异。原生质体培养也不例外，并且变异的可能性更大。这种变异在育种上有重要的应用价值。早在1978年，Bajaj等报道，颠茄原生质体培养所得到的再生植株之间发生不同的遗传变异，出现了单倍体、多倍体和非整倍体。在许多农作物原生质体再生植株中发现了体细胞无性系变异。在马铃薯的原生质体培养中，一些品种的叶肉原生质体再生的植株出现了广泛的表现型变异和染色体数目，倍性水平和结构上的变化。Ramulu(1983)从无性系变异中选育出具有优良农艺性状如抗马铃薯晚疫病和早疫病的株系，引起了育种家的较大兴趣。李耿光等从马铃薯(小叶子×多子白品种)叶肉原生质体再生植株中得到几个表型不同的株系，而母株经6年的无性繁殖也未出现变异。Ogura等(1987)在水稻原生质体培养中发现了高产和矮秆的植株，并进行了细胞学和大田试验。Johnson等(1984)在苜蓿原生质体无性系中观察到表型和染色体数目的变异。Sumaryati等(1992)在N．piumbaginifolia原生质体培养中获得耐盐和耐湿的突变体。植物原生质体培养研究在近10年内发展迅猛，取得了非常可喜的进展。主要表现在许多重要经济作物原生质体培养成功地获得再生植株，一些作物如烟草、马铃薯、水稻、油菜等原生质体培养技术已相当完善和成熟，已能应用于作物改良。虽然如此，今后的任务仍很艰巨：第一，要进一步突破尚未成功的重要经济作物的原生质体培养和再生植株；第二，原生质体培养已成功的种要扩大基因型，要选择有代表性的主栽品种和推广品种，扩大它的实用性；另外，目前往往有着技术重演性和稳定性差、再生植株的频率低不能满足育种的需要。因此，要求进一步完善和建立高效培养技术体系并使植株再生频率得到大幅度提高。植物原生质体融合技术和融合体成株研究近年也有了一定的进展，但细胞融合技术从总体上来讲还不够成熟，难于广泛应用。今后研究出一套实用的融合技术和建立杂种细胞高效成株体系应是当务之急。一对一融合技术实为原生质体融合、杂种细胞筛选、异核体培育成株于一体的实验体系。它具有简化程序、效率高的特点，应当努力使它完善和成熟。从育种角度来讲，在进行体细胞杂交时需注意：(1)有目的地选择亲本材料和多注意选择近缘种间的原生质体融合，这样易于得到所期望的优良性状杂种后代；(2)不仅要注意利用对称的体细胞杂种，而且要特别注意利用不对称杂种和胞质杂种。因为不对称杂种只是DNA重组没有额外的染色体，胞质杂种避免了胞质基因供方的野生性状进入杂种，其遗传性状稳定地遗传，最在希望成为能直接用于育种的简便途径。在进行植物原生质体培养和融合研究中，过去往往存在着只重视得到再生植株，至于再生植株的数量，是否获得后代重视不够，并且忽视再生植株后代的观察和育种上的应用。因此，应提倡同育种者相结合，取长补短，充分利用宝贵的再生植株为育种服务。植物原生质体培养作为一种实验体系，将为作物改良的应用研究提供理论基础和前提条件。原生质体融合作为植物的杂交手段，将会有效地应用于作物改良和新品种选育。在未来，植物原生质体培养和融合研究将会取得更大进展，日益受到人们的重视。在地球上以原生质体技术育成的新品种将会增加，用以造福于人类。【参考文献】：1 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