激酶【激酶】
细胞周期调节是一复杂过程。在酵母条件突变株中，已发现一类基因与细胞周期调节密切相关，称为细胞分裂周期基因(cdc基因)(L．H．Hartwell，1971)，它们控制着细胞周期的启动及各时相的转换，其中以cdc2基因最重要。该基因是唯一在两个控制点G1→S、G2→M均起作用的cdc基因，它编码分子量为34kD的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，P34cdc2激酶的活化是细胞分裂的增殖信号，它具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用，在细胞周期调节中起重要作用。
20世纪70年代初，Masui等从蛙卵中发现一种能促进细胞成熟和分裂的因子，称为成熟促进因子(MPF)。1976年Nurse等发现和建立了cdc2酵母突变株，cdc2基因的编码产物即P34cdc2激酶，后确定两者为同一成分。P34cdc2激酶广泛存在于从酵母到人等多种生物中，形成一个庞大的家族。不同生物种族，其结构虽有差异，但具有很高的同源性。如酵母与人的有63%同源性(G．Draetta等，1987)。该酵母由催化亚基和调节亚基组成。催化亚基分子量为34kD，调节亚基又叫周期素。催化亚基由约300个氨基酸残基组成，含一般蛋白激酶的基本序列，同时又含该家族的特征序列，即：EGVPSTAFREISLLKE。催化亚基有3个重要的功能区(G．Draetta，1990)：第1功能区在9～38位残基之间，是ATP的结合部位和该酶的活性部位；第2功能区在42～51位残基之间，是调节亚基的结合部位；第3+功能区在177～208位残基之间，是P13suc1的结合部位。P13suc1可与该酶高亲和力特异结合而使之广泛应用于实验研究，含P13suc的层析柱可抽提掉提取物中99%的P34cdc2激酶，且不影响其活性。此外，催化亚基的上14－苏氨酸、15－酪氨酸、33－赖氨酸、227－丝氨酸也具有非常重要的作用。调节亚基cyclin具有周期性积累和降解的特性，在细胞周期的特定时相与催化亚基结合。主要发现有3种cyclin：G1期cyclin、cyclin A、cyclin B。它们结构差异较大，但都含有一个相同的序列区域，即“cyclin box”。它们在细胞周期的不同时相发挥作用，G1期cyclin在G1末期与催化亚基结合，在G→S控制点起作用；cyclin A在S期和G2期与催化亚基结合，与DNA合成及S期向G2期的过渡有关；cyclin B在G2期末与催化亚基结合，可诱发有丝分裂。P34cdc2激酶对DNA复制和有丝分裂的诱发是必需的，在G1→S和G2→M两个控制点起中心调节作用。非洲爪蟾卵的提取物在体外能诱发DNA复制，但若将提取物中的P34cdc2激酶移走，则丧失诱发DNA复制的能力，说明P34cdc2激酶具有启动DNA复制的作用(J．J．Blow，1990)。但DNA复制的引发是一复杂过程，可能通过以下环节起作用：(1)对RNA聚合酶Ⅱ的调节作用：细胞由G1→S的移行需要RNA聚合酶Ⅱ指导下的基因转录，P34cdc2激酶可作用于RNA聚合酶Ⅱ，对其进行磷酸化修饰调节，P34cdc2激酶可通过促进RNA聚合酶Ⅱ指导下的基因转录，从而启动DNA复制(Pines等，1990)。(2)对SV40T抗原样蛋白的调节作用：把纯化的T抗原注入静止期细胞核中，可诱导DNA复制，T抗原带有使静止期细胞进入细胞周期的必要信息。R．Baserga认为，细胞内存在SV40T抗原样蛋白，并认为它是控制细胞增殖的主要成分。1989年Mcvey研究资料表明，T抗原如果不被磷酸化则无诱发DNA复制的作用。而体内外实验资料均证明T抗原是P34cdc2激酶的底物。P34cdc2激酶可能以细胞内T抗原样蛋白作为中间调节，以启动DNA复制。(3)对P53蛋白调节作用：P53是一个抗癌蛋白，有抑制细胞生长的作用，但突变的P53则具有促转化作用。P34cdc2激酶可磷酸化野生型P53(C．J．Marshall，1991)，磷酸化的P53与SV40T抗原蛋白的结合能力降低，使之抑制复制的能力减弱。此外，还可使突变型的P53磷酸化，使之稳定性增加，有利于其发挥促增殖转化作用。(4)对高迁移率非组蛋白的DNA结合功能的影响：高迁移率非组蛋白(HMG)是一类丰富的核蛋白，可影响色体功能和DNA复制。HMG－1是其中的一个亚类，为DNA结合蛋白，结合到DNA的A－T丰富区，在增殖细胞中HMG－1的表达增加，它与细胞分裂和保持细胞的未分化状态密切相关。体内外实验资料均证明，HMG－1是P34cdc2激酶的有效底物，磷酸化部位是53位苏氨酸残基，该部位正是DNA结合的部位，它被磷酸化后则与DNA的结合能力下降。虽然HMG－1与DNA结合后所发挥的作用不清楚，但P34cdc2激酶对DNA结合蛋白的亲和力的影响可能是其启动DNA复制的机制之一(R．Reves，1991)。如c－myc、c－myb的编码产物是DNA结合蛋白，它们同样受到P34cdc2激酶的磷酸化修饰调节。(5)对核蛋白的调节作用：核仁蛋白是一种分子量为92kD的核蛋白，在核蛋白体RNA的合成和成熟过程起作用，它可直接作用于染色体，也可通过RNA聚合酶Ⅰ调节rRNA基因的转录。实验资料证明，核蛋白亦是P34cdc2激酶的底物，它的磷酸化可促进其功能作用，使rRNA的转录增加。此外，另一种核蛋白NO38也受到P34cdc2激酶的调节，NO38在核蛋白体的聚合和转运中起作用，它的磷酸化可影响它与核蛋白体RNA及蛋白质之间的相互作用。DNA的复制需一系列蛋白质因子的作用，P34cdc2激酶还可通过促进蛋白质的合成而促进DNA的合成(L．M．Boy等，1990)。有丝分裂是细胞一分为二的过程，其中包括一系列重要过程如染色质凝集，纺锤体形成、核膜破裂等。利用无细胞体系可直接观察到P34cdc2激酶对上述过程的促进，说明其具有诱发有丝分裂的作用。很早就观察到组蛋白H1以细胞周期依赖方式进行磷酸化，在G1晚期、G－端的一个丝氨酸残基被磷酸化；在S期，相邻的另外两个丝氨酸被磷酸化；进入M期后，C－端的一个丝氨酸残基又被磷酸化，组蛋白H1的磷酸化与染色质凝集密切相关。组蛋白H1是P34cdc激酶最早确定的底物。目前体外测定P34cdc2激酶活性实际上就是测定其组蛋白H1激酶活性(E．M．Bradbury等，1974)。在有丝分裂初期纺锤体形成，它的形成对于核模的破裂和染色体向两极的移动必不可少。纺鍾体由中心粒和微管组成，微管在中心粒周围呈放射状排列。P34cdc2激酶在G2期与中心粒结合，并催化中心粒蛋白磷酸化(E．Bailly等，1989)，中心粒蛋白的磷酸化使微管的成核作用增强，而放射状排列在中心粒周围。P34cdc2激酶还可直接作用于微管(F．Verde等，1990)，促进其在间隙的解聚及在分裂期的重组，还可维持其长度的稳定性，这可促进微管参与形成纺锤体，以及帮助染色体向两极的移动。核膜由内外两层组成，由3种蛋白质组成的核板与核内膜、染色质和核孔相连。核板在维持核的稳定性中起重要作用，此外还与染色质重组、DNA复制有关。板蛋白是丝状蛋白质，结构与中丝蛋白相似。在分裂开始时，核蛋白发生磷酸化，其溶解性增强促进核板解聚乃至核膜破裂(B．Luscher，1991)。P34cdc2激酶可催化板蛋白的磷酸化，促进核膜破裂。而在分裂中晚期，在特异磷酸酶的作用下，板蛋白脱磷酸，核板重新合成。波形纤维蛋白和索蛋白是细胞骨架的组成成份，前者存在于胞质中，形成从质膜到核膜的网架结构；后者在核内聚积于核膜下面。它们的解聚与核膜破裂密切相关，同样，它们的解聚也需磷酸化修饰调节。免疫沉淀法显示，从细胞中提取的波形纤维蛋白激酶就是P34cdc2激酶(T．C．Ned，1990)，索蛋白也是该酶的底物。在细胞增殖分裂过程中，有一种蛋白发生高度磷酸化，即核蛋白体S6蛋白。胰岛素刺激细胞后使它的磷酸化程度急骤增强，S6蛋白的磷酸化可促进蛋白质合成。催化S6蛋白磷酸化的酶是S6激酶，该酶还可作用于核板蛋白，使之磷酸化而促进核膜破裂。它受PP60c－src磷酸修饰调节，而后者又是P34cdc2激酶的底物(D．Morgan等，1989)，即P34cdc2激酶可间接促进S6激酶活性。P34cdc2－cyclin复合物有3种形式，它们的活性调节方式有差异，但基本方式相同，以P34cdc2－cyclinB为例介绍其活性调节。磷酸化／脱磷酸化修饰调节：与许多蛋白激酶相反，P34cdc2激酶磷酸化后失活，脱磷酸则活化。在间隙期，P34cdc2激酶14－苏氨酸和15－酪氨酸残基磷酸化，该酶处于失活状态。在进入M期前一瞬间，两部位脱磷酸，激酶迅速被活化且活性达峰值。在M中后期，调节亚基的解聚引起激酶失活(J．Gautier，1990)。目前还未分离出特异的P34cdc2激酶激酶和磷酸酶。据1991年K．Lundgren等研究资料表明，Wee和MIK1两基因的编码产物可能是P34cdc2激酶酪氨酸蛋白激酶，cdc25基因产物可激活P34cdc2激酶，它可能是磷酸酶的活化剂。调节亚基的调节作用：调节亚基的作用是多方面的。第一，它是该酶活化所必需的，在间隙期cyclin B不断合成积聚，并与磷酸化的催化亚基结合(R．Booher，1989)，它的结合虽不直接使激酶活化，但是活化的必需前提，未与cyclin B结合的催化亚基即使脱磷酸也不能被活化；cylin B可能调节活性中心形成。第二，它调节激酶的底物特异性。Cyclin可能改变催化亚基的构象，使之与不同的底物相结合；也可能在底物与酶之间起桥梁作用，但只是推测，尚无实据。第三，cyclin的降解与激酶M期失活有关。进入M期后，由于特异的cyclin B磷酸酶和水解酶的出现，使cyclin B降解，调节亚基的解聚和降解使激酶失活。如果它的降解受阻，则可使激酶持续cdc2维持高活性。原癌基因c－mosxe的编码产物使cyclin B磷酸化，磷酸化后其稳定性增强使之不易被降解，因而c－mosxe过度表达则可引起P34cdc2激酶持续活化(H．Onkura等，1990)，有丝分裂不能顺利完成，细胞停滞于M期。生长因子是细胞增殖所必需的，某些癌基因的活化可使细胞获得无限增殖的能力，它们与P34cdc2激酶的关系尚不很明了。生长因子与受体作用后，经信息传导，增殖信息转变为细胞内的化学信号，其作用的最后靶点是否就是P34cdc2激酶，通过它而诱发细胞增殖呢?1990年Barrett等报道，胰岛素刺激后，细胞内P34cdc2激酶活性升高，但这并不能说明两者之间有直接关系。许多癌基因的产物如PP60c－src、C－abl的产物等是P34cdc2激酶的底物，受到该酶的调节，于是人们推测，细胞分裂过程中细胞发生的一些变化如附着力减弱、细胞变圆等，可能是P34cdc2激酶作用于癌基因产物而引起的。此外，发现P21H－ras和c－mos1产物均可作用于P34cdc2激酶，使之活性升高，提示癌基因的活化可能启动细胞周期的调控机制，使细胞不断增殖分裂，这为解释癌基因在肿瘤发生中的作用提供了新的途径。SV40T抗原样蛋白有促进DNA复制起动的作用，有人认为抗癌基因产物P53与P105－Rb都可与其结合，从而抑制其促复制的作用。P34cdc2激酶可使P53和P105－Rb磷酸化，磷酸化后的P53和P105－Rb与SV40T抗原蛋白的结合能力降低，抑制复制的能力因之减弱。P34cdc2激酶的研究翻开了细胞周期调控研究新的一页，揭示了从酵母到人都存在相同的调节机制，但对其作用的环节还有待更深入的研究，如cdc2基因表达的调控、cdc2基因与其它cdc基因的关系，特别是生长因子、癌基因与P34cdc2激酶的关系更是广阔的研究领域。(北京医科大学基础医学院生物化学教研究室蔡家新、童坦君撰)