| 单词 | 马铃薯体细胞融合和杂交技术 |
| 释义 | 【马铃薯体细胞融合和杂交技术】 拼译：technigues of somatic fusion and hybridization in patato 马铃薯四倍体普通栽培种的基因库比较狭窄，缺乏抗逆性和抗病性基因，急需从其他近缘或远缘物种中引进新的优良基因，以进一步提高马铃薯的育种水平。马铃薯家族中有数百个野生种，但它们大多数(75%左右)为二倍体，很难与普通栽培种杂交获得杂种。体细胞融合比通过有性杂交实现精卵细胞的融合可能性要大得多，可以大大地扩大远缘杂交的范围，增加引进外源种质选育新品种的机会。此外，体细胞融合的另一优点，是它不仅能像有性杂交那样实现双亲细胞核的融合，而且能够实现双亲细胞质的融合，实现叶绿体基因以及线粒体基因的重组，获得具有较强杂种优势的杂种，因而在选育杂交马铃薯中具有重要的意义。 体细胞融合技术的基础是原生质体培养。该方面最早获得成功的报道是1978年梅尔彻斯(G．Melchers)等，他们用马铃薯双单倍体(由四倍体性细胞发育而成的具有二倍体染色体数的单倍体)的一个叶绿素缺失突变体与番茄的一个变种“樱桃番茄”的原生质体进行融合，获得了杂种植株，取名为“马铃薯——番茄”或“番茄——马铃薯”。但是，所获得植株都是畸形的，既不能结薯，也不能长番茄，即使结实也很小，具有完全的不育性，表现出远缘杂种所具有的特性。染色体分析表明，其数目为50～72，没有一株是2n=48的异源四倍体，但DNA限制性酶切片和同功酶的分析表明，它们含有两个亲本的成分。在细胞质中，有些杂种含有马铃薯的质体(Pomatoes)，而另一些含有番茄的质体(Topatoes)。1980年，布滕柯(R．G．Butenko)等用马铃薯四倍体栽培种(2n=4X=48)与一个野生二倍体种(S．Chacoense)(2n=2X=24)融合，得到两株缺乏叶绿素的植株，有一株能正常发育，但染色体数目为2n=60，而不是72。1982年，秉汀(H·Binding)等用马铃薯普通栽培种的双单倍体(2n=2X=24)与一个具有抗除草剂“阿特拉律”的杂草“尤葵”(2n=72)进行体细胞融合，获得了染色体数目为2n=96、综合了双亲特性和具有抗“阿特拉律”的体细胞杂种。龙葵的抗此种除草剂的特性是母性遗传的，它可以通过细胞质的融合传递给体细胞杂种。龙葵与马铃薯是杂交不亲和的，不可能通过有性杂交获得杂种。体细胞融合和杂交使选育抗除草剂的马铃薯新品种成为可能。1983年，谢巴尔德(J．F．Shepard)等把由原生质体培养中得来的马铃薯叶绿素缺乏突变体(2n=48)与番茄(2n=24)进行融合，得到了4个植株，其染色体数目为两亲本之和(2n=72)，但经过切段繁殖之后，发现其染色体数目发生了变化，有丧失番茄染色体的趋向，在第2无性世代，有的无性系形态趋向马铃薯，有的趋向番茄。1984年，巴尔斯拜(T．L．Barsby)等用来自栽培品种“赤褐布尔班克”的一个白化突变体与不形成块茎的一个野生二倍体种(S．brevidens)进行融合，得到了具有两个亲本中间性状的有生活力的绿色植株，染色体数目在78～96之间，花粉败育，只能形成无籽果实。1985年，奥斯汀(S．Austin)等成功地将这个野生种与普通栽培种的双单倍体融合，把它对马铃薯卷叶病毒的抗性转移给了普通栽培种。他们还对来自普通栽培种的不同双单倍体品系间进行融合，获得的分化植株大部分为四倍体，在生活力方面强于亲本，同功酶分析和形态分析都证明是来自品系间的杂种而不是自体融合的产物。用体细胞融合进行种间或属间体细胞杂交有一个很大的缺点，即将野生种质中的不利基因也带入到杂种中，使远缘杂种因农艺性状不佳而得不到应用。如果能实现部分种质的融合，则可以避免种质完全融合带来的负作用。1987年，西多洛夫(V．A．Sidorov)等用由普通栽培种与二倍体栽培种S．phureja杂交产生的一个叶绿素缺乏的二倍体突变系与用60Co辐射处理过的一个二倍体野生种S．pinnatisectum进行融合，获得了一些非对称的杂种植株，并发现在杂种中有重组的叶绿体DNA。他们认为，把用辐射处理过的原生质体进行融合有利于实现野生种质部分基因的转移。1987年，育特瓦尔(B．A．Uijtewaal)等用8个一单倍体进行了融合试验，他们发现，在用一单倍体进行原生质体培养时，只有二倍体和四倍体出现(染色体的核内复制加倍)，但在用不同品系的一单倍体进行融合试验时，在再生苗中除了大部分为四倍体外，还有少量的三倍体出现，这说明一单倍体细胞的原生质体参加了融合。同功酶的分析表明，这些四倍体和三倍体大部分都是杂种。可是，在对愈伤组织进行同功酶分析时却发现有不少愈伤组织存在纯合体的谱带。从分化上看出，纯合细胞系的分化比杂合的慢，再生能力比杂合体差，在培养过程中往往竞争不过杂合细胞系。这一点对于马铃薯体细胞杂交极为有利，可以在不加任何选择条件下获得杂种。此外，他们还发现，一单倍体或双单倍体温室生长植株之间的生活力、长势等方面的差异与原生质体培养中的一些特性(如植板效率、分化能力、分化苗的生活力、长势等)并无明显的相关性。因而认为，无法从供体植株的长势或表现预测其在原生质体培养和细胞融合中的效果。1988年，德门林(S．Deimling)等用11个具有利用价值农艺性状的双单倍体(包括种间杂种、由一单倍体加倍得来的纯种的由组织培养中选出的一个抗晚疫病毒素和镰刀菌毒素的品系)、2个四倍体和1个用农杆菌转化得来的抗潮霉素(hygromycin)的转基因品系，进行了大量体细胞融合试验。由15个不同的试验组合中获得了6009株再生苗；在(2X)+(2X)的融合中，得到了10%以上的杂合体，它们在生活力、植株形态和块茎产量等方面都显然不同于亲本或同质融合的植株，很容易从长像上分别出来，无需采用特殊的选择方法，甚至同功酶谱的分析也可省略；在形态特征方面，区分杂合体与纯合体或亲本最好的标志是块茎产量。马铃薯体细胞融合和杂交的这些表现给育种中实际应用这一技术带来了很大的方便，可以作为一种常规技术在育种中应用。在马铃薯体细胞融合技术方面，与其他植物一样，除了用常规的聚乙二醇的化学融合法外，近年来也有不少关于用电融合法的报道。研究表明，原生质体在高频交变电场中其表面会电极化，形成“偶极子”。电融合法由于操作简便，效率高，并具有易于控制和同步性较好等优点，近来已开始在植物体细胞融合中广泛采用。也有人试验，把化学融合法与电融合法结合起来，效果更佳。在马铃薯中，最早应用电融合法的报导是1986年的卜衣特(K．J．Puite)等，他们用普通栽培种的双单倍体与二倍体栽培种S．phureja的原生质体在150V／cm的交变电场下，用1．2～2．0kV／cm，50μs的直流高压电脉冲进行冲击，得到了体细胞融合的植株，其中有18株经鉴定确定为真正的杂种。1987年，狄弗里斯(S．E．de Vries)等用几个抗氨基酸类似物的双单倍体品系作材料，用1MHz和100～200V／cm场强的交变电场和1～3kV／cm，10～500μs的脉冲进行电融合，也得到了融合的体细胞杂种。1988年，菲什(N．Fish)等用100V／cm，1MHz的交变电场和1．25～1．50kV／cm，10μs的方形脉冲，并采用在施加脉冲后于20s内使电场强度逐渐降至零的方法，用普通栽培种的双单倍体与二倍体野生种S．brevidens进行了大规模的电融合试验，总融合率达到20%～30%，得到了大量的愈伤组织和分化苗；形态学及同功酶鉴定证明，有21株是真正的杂种四倍体植株。1991年，谢拉夫(I．Serraf)等用1MHz、125V／cm的电场和1．2kV／cm、4μs的方形脉冲对普通栽培种双单倍体BF15与野生二倍体种S．barthaultii进行电融合，得到了25株杂种。其中14株为四倍体，8株为六倍体，2株为混倍体，1株为非整倍体。这个野生种叶表面具有丰富的腺毛，能抗蚜虫和叶蝉等的侵击，对于防止由这些昆虫传播的病毒流行(如PVY和PLRV等)具有重要意义。他们发现，在获得的六倍体中，有一些植株既表现多腺毛特征，又具有高产特性。在它们的细胞中具有两套栽培种的染色体组，是由两个栽培种双单倍体的原生质体与一个野生种的原生质体融合而成的；并且认为，这种在体细胞融合中增加栽培种染色组的方法，利用基因的剂量效应将有助于克服野生种质带来的不利影响，这比用连续回交的方法更为有效。1992年，马塞依(W．M．Mattheij)等用1MHz、100V／cm和1．3～1．6kV／cm进行3次直流电脉冲的方法，对普通栽培种的一个双单倍体无性系DH81－7－1463与一个野生二倍体种S．ciraeifolium进行电融合，从17个愈合组织中分化出了苗，其中8个表现杂种性状，有4株为四倍体。这4个四倍体植株都抗马铃薯白色孢囊线虫(Globedera pallida)，其中有3个抗晚疫病(Phytophthora infestans)。体细胞杂交技术中一个很重要的问题是如何从众多的未融合的或同质融合的细胞中筛选出杂种细胞。如前所述，在马铃薯体细胞杂交中，有不少研究者采用形态学、生活力强弱或同功酶分析的方法鉴定体细胞杂种。此法虽然简单，无需对材料进行特殊的处理和专门的仪器设备，但是，它并不是在任何情况下都能采用的(例如亲本性状差异不大、亲本杂合性本来就强，同质融合后生活力下降不显著以及同功酶谱差异不明显等)，而且要同时培养许多不需要的非杂种个体，影响了工作效率的提高。80年代初发展起来的“双重萤光法”，为高效率地挑选融合的杂种细胞提供了新的方法。对马铃薯采用这种方法者最早见于1986年卜衣特等的报道。他们在进行电融合之前，先将供体双单倍体品系在含有除草剂“达草灭”的培养基上繁殖一段时间，使植株失绿，在游离出原生质体后，将失绿的原生质体用萤光素二乙酸酯染色，把染上萤光染料的原生质体与在光下正常生长的二倍体种S．phureja的原生质体融合，进行电融合后1～2d，在萤光显微镜下，用显微操作器控制的微管对发出双重萤光的杂种细胞进行挑选(染色的细胞呈黄绿色，而含叶绿素的正常细胞产生红色自发萤光)，再配合以低密度(600～1200个细胞／ml)原生质体培养技术，成功地获得了18株种间体细胞杂种。1988年，他们又报道用一种较精密的“流式细胞仪”，用自动筛选法代替显微操作器的手工操作。1991年，瓦拉(S．Waara)等也报道，用电融合和双重萤光显微操作器挑选的方法，对由花药培养得来的普通栽培种的两个双单倍体品系进行融合试验，从挑选出的1363个杂种细胞中获得了166个再生植株，其中12%为四倍体。体细胞杂交除了获得两亲本细胞完全融合的杂种外，1990年伯尔(A．Perl)等报道，将具有雄性不育特性的普通栽培种四倍体品系游离出原生质体，用10krad的γ射线进行辐射处理，对受体两个品种的原生质体用0．25mmol的碘乙酸酯或10mg／L的若丹明处理30min，用聚乙二醇(PEG3350)进行融合，获得24个胞质杂种的愈伤组织，从其中再生出120个植株，它们的形态都与受体品种一致，其中有41株具有花粉不育性，有两株胞质杂种的花粉发育到四分体时期就停止了；有1株具有有柄的花药，胞质杂种线粒体DNA的限制性图谱既不同于供体亲本，也不同于受体亲本，说明在融合过程中发生了线粒体DNA重组。他们认为，通过体细胞融合，可以将准备用来作为生产杂种实生种子的母本品种转变成雄性不育，这对于大量生产实生种子、降低制种成本是十分有用的。体细胞杂交技术在马铃薯育种中具有重要的实用价值，它不仅可以扩大杂交的范围，引进外源种质获得远缘杂种，以解决栽培种基因资源贫乏的问题，同时还可利用品种或变种间的体细胞融合培育出具有高强度杂种优势的新品种。此外，还可利用自体融合实现一单倍体的染色体加倍，获得常规育种无法获得的四倍体纯系，为生产不分离的杂交马铃薯实生籽打下基础。通过核质融合产生胞质杂种的方法可以将雄性不育特性转移到母本品种中，为大量生产杂交马铃薯实生籽创造条件。今后的研究重点将集中在如何控制不对称融合，以及如何进一步提高四倍体在融合体中出现频率，如何更有效、更简单地筛选杂种细胞等方面。【参考文献】：1 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