| 单词 | 离体细胞的内源性诱变原理及其在水稻生物技术中的应用 |
| 释义 | 【离体细胞的内源性诱变原理及其在水稻生物技术中的应用】 拼译：endogenous mutational theory of plant cell in vitro and its application to rice biotechnology 离体细胞的内源性诱变原理高等植物体细胞在生物学、生理生化功能方面已高度分化，不同部位细胞不仅生理生化功能有别，所构成的组织也呈现不同形态。然而体细胞是有丝分裂的产物，其基因型完全相同，故不同分化状态的实质是各细胞中有关基因的活化和抑制状态不同。根据基因结构和调控的分子生物学本质，这是相同DNA序列与不同基因调控物质相互作用的结果。高等植物基因组庞大，基因数目众多，高度分化使得在任何生命阶段，细胞内都存在众多不同功能和不同类型的调控物质，它们决不可能在培养基中的一两种外源激素作用下就都降解或失活，否则，高等植物就不可能维持其复杂的生命过程。从分子结构上看，外源激素也不可能有这么广泛的化学活性。这些基因调控物质原本就是与DNA发生物理或化学反应的，离体细胞中的基因调控物质失去了植株的系统控制，就有可能因对应的抑制物、底物或中介物的缺失、不足以及改变等各种原因，使DNA局部发生不可复原的化学变化。调控物质的多样性及其失控后作用位点的随机性导致了多样化的遗传性状改变。外源激素能刺激离体细胞分裂生长，内源性诱变结果便得以生命形式“保存”下来并随培养细胞的再分化使再生植株的性状出现与原初植株不同的变异。 前人研究已表明，培养基内添加化学诱变剂并不能提高体细胞无性系变异的频率。显然，体细胞无性系变异的直接引发条件应该是“离体”本身，而不是外源激素等外部培养条件。植物细胞的离体培养和植株再生能力也是原分化状态在离体培养中具有“后效应”的明显例证。同一植株上不同部位的体细胞的DNA序列相同，遗传上是同质的，若细胞的分化状态对培养性状没有影响的话，根据基因决定性状的基本理论，在相同的培养条件下理应有相同或相近的培养效应。然而大量研究报告却指出，不同外植体的培养和再生结果差别极大。例如，禾谷类通常是来源于盾片或幼花序的愈伤才能再分化出植株，其他部位外植体不能或非常难以培养和再生植株，至今都还没有消除这种差别的方法。显然，这种巨大的差异与外部培养条件并无直接的因果关系，它由原外植体细胞的分化状态决定，是原来分化状态的一种后效应。在水稻生物技术中的应用1．杂交稻恢复系的配合力育种方法。(1)杂交稻亲本配合力改良新途径。现行的配合力育种方法是针对玉米异花授粉生殖特点和杂合体种质，用自交制造变异和分离，经选择淘汰不良基因型、加大基因型间的差异。选得的优良自交系则用“轮回选择”进行群体改良，使有利基因逐步富集，配合力不断提高。自花授粉作物是“纯系”，自交不能引发分离。杂交稻恢复系种质资源不但数量很少，还多少有些近血缘，也无法直接用轮回选择程序来改良。分析轮回选择的原理便不难发现，如果有一种非杂交性质的方法能使它产生配合力变异和分离，就可以进入轮回选择程序，实现配合力的持续改良。前人研究表明，水稻体细胞再生植株及后代能出现较大幅度的可遗传变异，变异涉及较多经济性状，变异频率也较高。自60年代以来，用这种方法已获得了大量的水稻体细胞无性系变异，如抗白叶枯病、抗胡麻叶枯病、抗稻瘟病、抗氨基酸、耐盐、耐重金属、品质和产量超亲、黑米突变体等。那么，能否使之配合力产生变异呢?笔者经过3年多的研究后发现，经“轮回再分化”即经过连续几次的“脱分化培养一植株再分化”交替后，恢复系再生植株在穗粒数、株粒数、株粒重、株穗数等主要经济性状的配合力产生了非常明显的变异。这种再生植株与原不育系测交杂种主要经济性状的变异系数可数倍于原来杂交稻，一半组合的平均株穗数比对照多0．3～1个，最高单株多3个，单株小花数最多比对照多35．2%，在较小群体的变异源世代中可检测出高达5%～10%的株粒重超过原来杂交稻最高单株的超高配合力雄配子。“轮回再分化”不仅能使纯系产生配合力的体细胞无性系变异，其后代也完全有可能选出纯合的超高配合力变异植株。(2)轮回再分化配合力改良的育种学原理。一个体细胞包含的遗传信息等同于一个植株，离体培养中每分裂一次，遗传物质传递的结果相当于植株一个世代。内源诱变导致的各种基因型变异中，生活力，生长势弱的不良基因型细胞在生长竞争上将被自动淘汰，只有生活力好的优良基因型细胞才可能再分化出植株。就育种学效应而言，培养物在无性增殖过程中已经历了若干次自然选择。再生植株及后代出现的各种可视变异，又可进行人工选择。这样，经无性增殖－有性繁殖交替后，不仅从纯系诱发出了非杂交性质的基因型变异，而且还实现了细胞和植株两种水平上的多次选择。配合力是数量性状，其分子水平实质虽还不了解，但从数量性状容易受到环境因素影响的现象来看，微效多基因系统是较易被内源性诱变的，水稻体细胞无性系容易出现生育期、分蘖力、株穗数、粒重、结实率等变异的事实也证明了这点。将这种非杂交性配合力诱变方法与轮回选择原理相结合就可实现对种质非常有限的杂交稻亲本的配合力的持续改良。每一轮回的基本程序为“内源诱变(轮回再分化)→体细胞无性系配合力变异的分离和选择→优良株系间杂交→选择或测交”。以恢复系配合力为例，首先用轮回再分化制造出配合力体细胞无性系变异，然后在优良变异植株间或在经测交选出的高配合力变异株系间进行杂交重组，最后通过选择或早代测交选出的优良株系，完成一个轮回；一个轮回后选出的高配合力株系可令其自交，在稳定后代中选出纯合的高配合力植株，也可以直接进入下一轮的“内源诱变－分离－杂交”轮回选择。在任一轮回的第三步还可以与不同品种诱发的高配合力衍生株系间进行杂交重组。(3)实现持续改良。内源性诱变是失去植株系统控制的高随机事件，每次内源性诱变的位点和结果不可能完全相同。如此往复循环，不仅可从一个纯系衍生出一个含有大量不同基因型的复合群体，使原来贫乏的种质基础丰富起来，而且随轮回进程，内源性诱变、有性杂交、分离、选择的不断进行，选得群体中的期望优良基因的频率将会随上述进程不断提高和富集。前人指出，配合力与可见性状的优劣并不一定成正比。异花授粉作物自交系进程中，植株生活力和经济性状均明显下降。水稻体细胞无性系变异的总趋势与之类似，主要性状变劣，植株生活力下降。国外也有过烟草经过多轮反复花药培养，植株逐渐变小变矮的报道。看来，植物在离体培养植株再生过程中所具有的这种“类自交系效应”以及水稻体细胞无性系通常又有增蘖、矮化等对杂交稻明显有利的变异趋势已经在某种程度上暗示我们，这种方法很可能就是杂交稻配合力改良的有效方法。(4)实用与适用价值。内源性诱变具有可靠的诱变物质基础，其“诱变性能”不会中断或失去。内源性诱变培养时间短、成苗容易、通常没有白化苗问题，同时其变异植株稳定也较快。目前组培设备和技术已很普及，因而，这种以细胞工程内源性诱变技术与常规育种学轮回选择原理相结合的配合力育种方式，可望为杂交稻超高产育种提供另一种新途径。自花授粉作物因花器构造所限，杂种优势利用大多离不开“人工强制的”雄性不育，无论用什么类型的杂种，都常会有某系遇到类似的种质不足所致的配合力改良问题。因而本文所讨论的方法也很可能对自花授粉作物杂优利用具有普遍的意义。2．籼稻培养细胞植株再分化力的遗传改良。在生物技术作物改良中，受体是细胞或组织。能否从培养细胞或组织再分化出完整植株和再分化率的高低已成为作物遗传工程的一大关键。至今能获得原生质体再生植株的籼稻品种不仅数量很少，植株再生率也很低，一个主要的原因是籼稻培养细胞的植株再分化能力低下。因为基因工程通常只能向受体细胞导入个别基因、对个别性状进行“点修饰”，实用化受体系统必需有良好的综合农艺性状。所以，用我国大田籼稻品种来进行再分化力遗传改良，建立综合农艺性状和再分化力均好的工程植株是生物工程育种实用化体系的必需基础性工作。(1)植株再分化力人工改良的可行性根据和改良方法。前人对玉米、小麦、苜蓿、籼稻等进行的研究均表明，离体培养细胞的植株再分化能力是一个由基因控制的显性遗传性状，这为对其进行遗传改良提供了理论根据。采用了“离体培养－植株再生－自交结实－再离体培养和植株再生……”的轮回再分化方法对此性状进行非杂交性遗传改良。再分化力在无性与有性增殖的多次交替中成为可进行人工选择的可直视性状。每轮仅从单胚成苗多、苗壮、再分化早的愈伤单位中选壮苗种植和进行下一轮的离体培养和选择。(2)改良的效果。在数十个我国籼稻大田品种中选6个有一定植株再分化力的品种，用轮回再分化法对其培养细胞的植株再分化力进行遗传改良。4～6个(代)轮回后，盐籼156、明恢63、特青、中87－156等4个品种的未成熟胚愈伤的植株再分化率提高到原始品种的2．9倍、2．4倍、2．4倍、1．6倍；其中盐籼156自4R0起，未成熟胚愈伤的植株再生率就稳定在80%以上，至6R0代，植株再分化率达96%，每胚愈伤成苗20株以上，其再分化力已能满足籼稻生物工程的需求。这种改良方法是使无性增殖和有性生殖不断交替进行，外植体的无性增殖产物要通过减数分裂产生新个体后才有可能进入下一轮培养。只有遗传物质导致的变化能经减数分裂传递，因而，经轮回再分化后再分化力的改变不可能是对离体培养条件的生理性或适应性结果，而应是相应基因型改变所致。(3)轮回再分化改良植株再分化能力。前人研究已指出，植株再分化力是显性性状，所以，再生植株必定是带有显性再分化基因的杂合体n(Aa)或显性纯合体n(AA)的基因型，而隐性纯合体n(aa)因不能再生植株在每个自交一离体培养轮回中均被淘汰出局。通过连续几个有性－无性交替和选择，只让植株再生快、苗多苗壮的愈伤后代进入下一轮回，植株再分化率就会随着群体中显性纯合体和杂合体的逐步增加而提高。由于杂合体与显性纯合体表型相同会导致选择偏离期望群体以及植株再分化性状的多基因属性带来的复杂性，用这种方法还不可能获得100%再生的理想材料，也难以做到使每个品种均有实用意义的提高。但根据自交效应理论推断和笔者的实验结果，把再分化力提高到原初材料的1～2倍以上是完全有可能的。体细胞无性系变异：离体培养细胞的内源性诱变特性可使脱分化培养细胞产生广泛的体细胞无性系变异。这种高频率的随机致变也不可避免地会使植株再分化性状的编码或调控基因状态产生变化，选择苗多苗壮、再生性能好的变异类型的自交后代反复进行内源性诱变和选择，后代群体中的高再分化力基因型不断累积也很可能是植株再分化力得以提高的原因之一。(4)应用途径。盐籼156的植株再分化力改良影响应较好，但它的愈伤组织质地太硬，液体培养响应差，褐变期长，较难建立起悬浮系。改良后的明恢63虽然植株再分化率不及盐籼156，但其培养物具有褐变期短、分散性好等良好的悬浮培养响应。同时，明恢63不仅综合农艺性状比盐籼156好而且其植株再分化率也已提高到40%左右。因而，将两者的杂种F1作为籼稻生物工程植株将有可能较好地兼顾对受体再分化能力和综合农艺性状的要求。禾谷类大多需要建立悬浮培养物，而悬浮系的植株再生能力总是会随培养时间的延长而逐步丧失。在重新建立新的悬浮系时，采用取自再生植株的外植体也将有可能有助于悬浮系再生能力的逐步提高。【参考文献】：1 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