| 单词 | 光学实时监测脑神经元膜电位 |
| 释义 | 【光学实时监测脑神经元膜电位】 运用光学方法研究神经元膜电位活动是1968年由L．B．Cohen等提出的，他们发现枪鸟鲗巨轴突膜的内部光学特性随着动作电位而改变。同年，I．Tasaki等报道外部染色的轴突标本发出的荧光随刺激而改变。此后，Cohen实验室从1971年开始寻找能给出强光学信号的适宜化合物，用以监视神经细胞膜的电位变化。到1978年，他们所合成的一些化合物使信号噪声比提高100倍。 提供使用的膜电位分子探头已超过200种，其中一些类型如下：XV11，部花青类，用于测量吸收作用，双折射；RH1155，氧鎓醇类，用于测量吸收作用；RH414，苯乙烯基类，用于测量荧光；XXV，氧鎓醇类，用于测量荧光、吸收作用。对于染料光学特性的测定包括吸收作用、双折射和荧光3种信号的强度，目的在于选出最高信噪比的物质。测量哺乳类动物大脑皮层时，若没有在皮层下植入光导纤维，则使用透射光是不可能的；然而，使用反射光可以测到较小的吸收信号(W．N．Ross等，1977)，故可以使用荧光测定(H．S．Orbach等，1985)。要选用一个电压敏感性分子探头监视神经细胞的膜电位变化，应了解其时间分辨率。例如，使用XV11染料进行枪鸟鲗巨轴突实验时，它产生光学信号后继膜电位变化的时间常数小于0．01ms，超过可兴奋细胞电学信号产生的速率，因此，同时记录电学信号与光学信号时，波形吻合极好。这些染料对神经细胞的药理作用很重要。在许多例子中得到最大光学信号所需的染料浓度(0．1～0．01mg／m1)尚低于可测出药理学效应的浓度。包括在枪鸟鲗巨轴突，组织培养中的成神经母细胞、心肌、骨骼肌、藤壶的上颈神经节、胚胎鸡心、胚胎半月神经节、口神经节中进行的测定。在行为观测中，用染料与不加染料的正常藤壶进食行为没有差别：长期饲养中的行为也未发现药理学影响(J．A．London等，1987)。有些染料的分子在强照明下可以敏化具有活性的单态氧和其它自由基。这些活性基会破坏膜成分并损伤细胞(J．P．Pooler，1972)。因此，这种光动力学损伤限制了实验的持续时间。目前提供的几种透射分子探头连续使用1～5min可不产生显著损伤。如果只用直流记录，每次测试50ms则可在出现明显损伤前进行1200～6000次测试。当然，使用一些抗氧化剂清除自由基可能是有希望的。此外，在强光照射下染料被漂白也是一个限制实验时间的因素。精确测量光时会受到系统中固有散粒效应噪声的限制。这是由光子发射和检波的统计学特性引起的，从而使单位时间光子发射数量出现波动。钨丝光源平均发射1014光子／ms。发射数目均方根的偏移是单位时间光子发射数量的平方根，即107光子／ms。在受到散粒效应噪声限制的情况下，信噪比与测得量子数的平方根及光子测量系统的频带宽度成正比。在这种条件下进行测量，如果要改进信噪比就只能增强照明强度或测量系统的聚光效应，或者降低放大器的频带宽度。实际上，在1815C温度下，钨丝发射1014量子／ms中只有一小部分到达光探测器、一个理想的数值孔径(NA)为0．7的物镜可以收集0．06的发射光。但在发射和收集的光子中只有0．2是在可见光的波长范围，其它均为红外线(热)。如果再加上通过干涉滤光片(30nm)，约只可透过0．05可见光以及集光器和空气－玻璃界面损失的光。那么，真正能到达标本上的光一般都被降低1010光子／ms(L．B．Cohen等，1986；H．P．Hopp等，1990)。用于记录系统的光探测器选用硅二级管，它比光电阴极射线管的信噪比至少高2．5倍。通过硅二极管将电压敏感性染料的发光效应转换为电学信号；再经过放大器，信号增益为±10V被送入多路调制器和模－数转换器。硅二极管排列呈方阵，如10×10和12×12阵。由于生物标本多为近圆形，所以方阵的四角部位可不利用。这样，同时可监测多达124个位点。每个二级管的受光面为1．4mm×1．4mm方块，相邻方块的绝缘区厚度为0．1mm。近年已出现24×24二极管阵提供使用。与此相应，Cohen实验室也已完成464个探测器的监测系统。光学记录方法用于神经系统研究时，由于标本的形状各式各样，而且不同的神经元直径相差很大，可以从几个μm到几百μm。因此投射到一个固定大小的二极管阵上，对于每一个探测器就可能具有3种不同的情况：一个细胞的活动被记录在多个探测器上，并产生相同的信号；一个细胞刚好覆盖一个探测器的整个区域，因此产生一个较强的反应，其中有些探测器只投射到细胞的边缘，则反应量较小；一个探测器记录多个细胞的活动，如3个细胞的切面都投射到一个探测器上，可称为多细胞记录。借助各种染料，利用光学信号，已经测试过多种类型标本膜的反应，其中既有慢反应，也有快反应。一些慢反应称为重新分配信号，用于研究细胞或细胞器在悬浮液中的膜电位。这种信号的时程受膜通透性的限制。血红细胞膜电位的时程可大于100ms，而快反应适合于监视可兴奋膜电位变化。利用重新分配信号或快信号都可以在1～30ms内测定膜电位的变化，但重新分配信号比快信号强10倍。另一方面，如使用这两种信号测量1～3ms内短暂的电位变化时，则快信号要比重新分配信号强10倍(H．P．Hopp等，1990)。测试过快反应的标本包括：骨骼肌和心肌的表面膜和t系统膜；骨骼肌的肌浆内质网；无脊椎动物神经系统中的神经元；Hohsoma唾液腺：培养的成神经细胞、神经元；哺乳类动物海马脑片；脑体脑结构；哺乳类动物视神经、神经垂体、下丘、蝾螈嗅球；活体哺乳类动物大脑皮层，嗅球、蛙顶盖等(A．Crinvald，1985)。1991年，24×24探测器阵开始用于实验研究。由于分区更加精细，进一步提高了空间分辨率。这样对神经细胞的标定要求就更加广泛。即使在低等动物简单神经系统中，如何分辨大量的中间神经元，也是一个艰巨的任务。使用光学记录方法的好处是可增加对神经细胞生理反应群体的认识；在一群被激活的神经细胞间存在的跟随关系及是否参与生理效应和行为问题的研究；大脑和中枢神经元的机能构型，发放的信号进行协同与拮抗以实现对行为调控等问题的探索。总之，许多这种类型的课题如果以电学记录方法与光学记录方法结合或配合使用，将使大量假设得到验证。为了说明光学记录技术的使用对脑研究的促进，举出一个对熟知标本的研究可能是有益的。如海兔吸水管射水所引起的缩鳃反射，一般认为其神经环路是简单而明确的(A．Crivald，1985)，由机械刺激兴奋感觉神经元，通过兴奋性中间神经元连接运动神经元而支配鳃收缩，最多包括由吸水管传入到24个机械感受神经元，投射到6个运动神经元。Kandel实验室利用这个标本和图解已开展深入研究。直到1989年由Zecevic等用光学记录方法查明，触动吸水管外皮引起缩鳃反射约涉及300个神经元。由此证明，缩鳃并不是一个简单反射，还需要确定触动水管外皮到底使哪个(些)“触觉神经元”兴奋，缩鳃又是怎样使运动神经元激活；此外，其它又是些什么神经。这样，才能进一步探讨与一次缩锶反射机能相关的神经元间连接的特性及其构筑关系。当然，涉及到各种反射的中间神经元群及其间的机能构筑也引人注意。进一步改善光学测量膜电位信噪比的努力仍在继续，正从几个方面试探，发现具有其它较大变化光学特性的可能性，例如能量转换、圆二色性或吸收作用加强喇曼散射等特性；改进设备，如使用新光源，并对具有实体散射或厚度的标本使用共聚焦显微镜，均可大大改善空间分辨率；寻找或设计更好的染料。(北京大学张人骥撰) |
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