| 单词 | 蛋白质的荧光探剂 |
| 释义 | 【蛋白质的荧光探剂】 拼译：fluorescence probe of protein 荧光探剂又称荧光探针，是指某些小分子量荧光试剂或非荧光试剂，与某些大分子结合，使被结合的分子标记上发射特定波长的荧光。荧光探剂可用于标记细胞及生物大分子(如抗体，蛋白质和核酸等)，在分子生物学、医学和法医学的领域中有着越来越多的研究和应用。 对于被研究的分子来说，荧光的产生有内源与外源之分。内源荧光又叫内禀荧光，是分子自身所具有的；而外源荧光是指分子结合环境中的荧光物所获得的荧光。荧光探剂属于外源荧光。在常温下，特定能量(波长)的光照射荧光发色团，产生小于入射光能量的特定波长的光叫荧光。产生荧光的前提是分子中具有共轭振动结构、刚性平面及适当的带电状态。在常温下，大多数分子处在基态的最低振动能级，当一定波长的激发光照射荧光发色团时，受激分子的电子吸收具有特征频率的能量，由原来的能级跃迁到第1电子激发态或第2电子激发态中各个不同的振动能级和转动能级。大多数分子在吸收光能激发至第一或更高的电子激发态的各个振动能级后，通常迅速降落至第1电子的最低振动能级，在这一过程中它们和同类分子或其他分子碰击而消耗相当于这些能级之间的能量，因而不发荧光。由第一电子激发态最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同的振动能级时，这一部分能量则以光的形式发出，所产生的光就是荧光。荧光具有激发能量和发射能量的特征性，灵敏度高，测定时操作简单，样品用量少(最低可到10－10mol／L)等优点，使它在分子的定性分析和定量分析中获得大量的应用。在利用荧光光谱对分子进行研究的过程中，由于很多分子本身不具有发射荧光的能力，因此，必须给这些分子引进特征荧光探剂，让荧光探剂结合在分子上，从而研究被标记分子的性质和运动过程。根据荧光探剂与分子的结合方式，荧光探剂可以分为共价探剂与非共价探剂。用于蛋白质分子的非共价荧光探剂有ANS，DNS和TNS等。它们能与许多蛋白质分子结合，根据结合以后荧光性质的变化，可以判断蛋白质分子中是否有疏水微区。ANS(8－苯胺基－1奈磺酸)能与去辅基肌红蛋白或去辅基血红蛋白结合，结合前在水溶液中ANS的量子产率和最大发射波长分别是0．004和515nm，结合后量子产率增高，最大发射峰蓝移，相应变为0．98和454nm。由此可以推测，与ANS结合的部位是疏水性很强的微区。其他实验资料表明，ANS是与去辅基肌红蛋白或去辅基血红蛋白结合的部位是它们与血红素结合的部位。共价荧光探剂有碘乙酰胺萘酚(IAN)，它与巯基发生反应，形成460nm的荧光。可应用该荧光探剂研究蛋白质分子的空间结构与功能的关系，在蛋白质分子中的两个已知位置上以共价键分别结合两个不同的荧光探剂A与B，当A受光激发能将激发能转移到B上，B便发射荧光。由于能量传递的效率与它们之间的距离的六次方成反比，因此，根据这一规律可以测定蛋白质分子中两个基团的空间距离。在法医学中，利用蛋白质的荧光探剂喷射物品上的指纹，使指纹带上荧光，进行指纹分析。在DNA及RNA的电泳分析中，加入的溴乙啶(E．B．)分子能插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物，在254nm波长紫外光照射下，发出橙黄色荧光。检测DNA的灵敏度达到ng(10－9g)水平。另外，在临床检验中所用的荧光酶联技术和荧光抗体分析技术是荧光探剂在定性分析和定量分析中的成功典范。荧光探剂在蛋白质分子的结构与功能的研究中起到重要的作用。1979年，中国邹承鲁等发现3－磷酸甘油醛脱氢酶活性部位的底物荧光探剂——NAD荧光衍生物。应用该荧光探剂标记酶的活性部位，从而进一步证实酶的活性部位位于分子的有限柔性区域，在变性过程中酶活性部位的空间结构首先遭到破坏(He等．1991；Xie，等．1987；Ju，等．1988)。后来又发现蛋白质分子N－末端的特异性荧光探剂——羰酰及喹喔啉荧光衍生物(赫荣乔等，1991)。与dansyl－Cl(Gray，1967)不同的是，羰酰荧光探剂是在温和的条件，蛋白在较大程度上保持天然状态下形成的；而dansyl－Cl本身具有较强的荧光，在蛋白质分子变性的条件下与氨基结合使N－末端带上荧光。应用羰酰及喹喔啉荧光探剂能较为容易地证明新生肽链的N－末端甲酰化的现象；另外也通过这些荧光探剂发现胰岛素分子N－末端及附近区域在变性过程中存在一个相对稳定的变性中间态(赫荣乔，1992)。荧光探剂在微量分析中亦有广泛应用前景。Udenfriend首先引入荧光胺试剂将氨基酸、肽及蛋白质的测量提高到微微克分子的水平。但由于试剂昂贵，产生荧光不稳定及其他原因限制了荧光胺的进一步应用。Both(1971)引入OPT作为一种廉价、高灵敏度荧光试剂。OPT在碱性介质中，当有还原剂如巯基乙醇(2－mercaptoethanol)、二硫苏糖醇等存在时，在常温下与氨基酸发生反应形成强烈的荧光(Ex 340nm；Em 450nm)。OPT不与脯氨酸和羟脯氨酸反应并且与胱氨酸及赖氨酸反应不完全。但它的灵敏度比茚三酮高5～10倍，荧光产物亦有一定的稳定性。因此，OPT荧光探剂现已被应用于氨基酸分析仪系统。最近，上海生物工程中心李昌厚等人利用OPT与氨基酸结合形成荧光衍生物的特性和流动注射荧光分析法(IFA)，超微量分析了某些氨基酸，取得较好的效果。【参考文献】：1 Gray W R. Methods in Eeaymology,Hirs,C H N (Ed),Ac-admic Press,New York:1967,ll: 1392 Roth M. Anal. Chem. ,1971,43:8803 Tsou C L, Xu G Q, Zhou J M, Zhao K Y, Biochem Soc Trans, 1983,11:425～4294 XieGF.TsouC L. Biochim Biophys. Acta,1987,911:19～ 245 Ju M,Tsou C L. in Advances in Membrane Biochemistry and Bioenergetics. Kim, C H. ,Tedeschi, H. ,Diwan,J and Salerno, J C. ,eds 1988,507～515,Plneum Publishing Co. New York6 He Rong -Qiao and Tsou Chen-Lu,The Biochem. J. (BJ), 1992,287:1001-87 赫荣乔，邹承鲁．生物物理学报，1991a，7∶430～4378 赫荣乔，邹承鲁．1991b，7∶363～3699 He Rong－Qiao，et al．Biochim．Biophysi．Acta(BBA)，1993，1163∶315～20(中国科学院生物物理研究所博士生导师赫荣乔撰) |
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