| 释义 |
【异源基因在酿酒酵母中表达】
酿酒酵母Saccharomyces Cerevisiae是单细胞真核生物，它不仅具有原核生物的生长快、便于培养和遗传操作等优点，还具有典型的真核生物的特性，并且不产生有毒产物，因而被认为是表达异源蛋白，特别是哺乳动物蛋白的最适寄主。用酿酒酵母表达和生产自然界稀少的医用蛋白更具有重大的社会意义和经济意义。此外，酿酒酵母又是最重要的工业生产菌株，但它只利用单糖和双糖进行发酵，将外源的碳水化合物水解酶系导入酿酒酵母，使其能直接利用例如生淀粉或粗纤维等进行发酵，生产酒精或其它有用物质，已成为当前研究的另一热点，并且已取得突破性进展，这项研究的成功，将会引起发酵工业的革命性变革。 酵母克隆系统的建立始于20世纪70年代末。1978年，伯格斯(Beggs)和海能(Hinnen)等分别报道用含酵母核DNA的杂种质粒对酿酒酵母的成功转化。1979年，史特鲁尔(Strubl)等报道一套可供酵母转化用的Y载体。主要研究进展是利用酵母的内源2μm质粒片段或整个2μm质粒同表达框架(expression cassette)和选择标记融合，创造出高拷贝数的稳定的嵌合质粒。1981年，希什曼(Hitzman)等第1个报道用酵母生产哺乳动物的白细胞α－干扰素，表达系统为含ADHI启动子的表达框架。目前，已构建成功一系列可供酵母转化的克隆载体和表达载体(见下表)，其中以2μm环为基础的载体，由于具有较高的拷贝数、稳定性和转化效率而被广泛采用。nogenesis表：酵母克隆载体特性表nogenesis
为使异源基因能在酿酒酵母中高水平表达，必须将异源基因正确地连接到酵母表达载体的启动子和终止子之间，构成一个表达框架。质粒载体在酵母中的稳定性和拷贝数是决定异源基因能否在酵母中表达或表达水平高低的重要因子。以2μm环为基础的高拷贝数载体可携带高剂量的异源基因，但会降低转化子的生长速度；此外，它在非选择条件下，每代约有1%的丢失率，因而在工业生产上是不可取的。采用整合型载体，将异源基因整合到酵母染色体中，虽然只有一个拷贝，但由于不影响细胞生长，并且高度稳定，因而仍能达到相当高的表达。例如，1988年柯尔(Cole)等构建的含泡盛曲霉(Aspergillus awamori)糖化酶基因的酿酒酵母工程菌，在以25%可溶性淀粉为碳源的酒精发酵中，以2μm环为基础的工程菌C468∶YEpPM18的酒精产量为25．6g／L，碳源利用率为68%，而用整合载体构建的工程菌C162∶YIpPM202则分别达到118．2g／L和93%。用于酿酒酵母表达异源基因的启动子分两类：一类为组成型启动子(解糖启动子)，例如PGK(3－磷酸甘油酸激酶)、ENO1(烯醇酶1)、GAP(3－磷酸甘油醛脱氢酶)、ADH1(ADC1)(酒精脱氢酶)、TPI(磷酸三糖异构酶)、PYK(丙酮酸激酶)和MFα1(信息素α因了)等基因启动子(Shuster，1989)；另一类为诱导型启动子；例如PH05(酸性磷酸酯酶5)、GAL1(半乳糖激酶)和GAL10(半乳糖差向异构酶)等基因启动子。不同的启动子对不同的异源基因的表达调节水平不同。例如PGK是一个强启动子，当存在于多拷贝质粒载体中时，PGK酶产量达总细胞蛋白的80%，这对寄主菌的生长是不利的；而牛凝乳酶的产量仅为总细胞蛋白的5%，α－干扰素仅为2%(Mellor等，1983)。GAP也是一种强启动子。海能等(1989)证明，在不同长度的GAP启动子片段控制下，水蛭素(hirudin)的表达水平明显不同。如含全长GAP(1100bp)时，产量为0．1～0．2mg／hr／L／OD600，并使拷贝数由14降到4～5，GA－PCL(391bp)虽表达量可高达2．7mg，但质粒易丢失，不适合生产应用。培养条件可明显影响启动子的作用。例如，1982年妥特(Tuite)等证明，在用PGK启动子起动α干扰素合成时，在醋酸盐培养基中加入葡萄糖，可使产量提高20～30倍。又如PH05启动子，由于该基因的表达受培养基中无机磷的调节，在最适的无机磷和碳源的供应下，可在发酵过程中诱导细胞生长和产物积累。1989年，海能等将强启动子GAP的下游启动子因子同调节启动子PH05的上游激活序列(UAS)结合，构建成兼具两种启动子特性的杂种启动子PH05／GAP，对Eglin在酿酒酵母中表达有明显的解阻遏作用。分泌信号是酵母菌表达的蛋白在起始分泌、糖基化、折叠和加工等方面不可缺少的因素。由于酿酒酵母的分泌系统与高等真核生物细胞的很相似，所以还能利用异源(如哺乳动物等)的分泌信号指导蛋白分泌。已有资料证明，许多哺乳动物蛋白能在酵母中合成，并以活性型分泌到胞外，分泌水平约为50～100mg／L，这是用其它微生物寄主达不到的。这种水平对生产自然界稀少的医用蛋白非常有意义。酵母的α－因子是一种最有效的分泌信号，它是一种只有13个氨基酸组成的疏水短肽，主要结构基因MFα1编码前原α因子(pre－pro－α－factor)(ppαf1)。这种以MFα1编码的ppαf1前导区已被用于指导酿酒酵母分泌异源蛋白，例如表皮生长因子、－α干扰素、降血钙素、凝乳酶原、白细胞介素－2、胰岛素原和人免疫缺陷病蛋白等。酿酒酵母能使表达的异源蛋白在分泌过程中发生糖基化和有效折叠。外源蛋白在酵母细胞中可发生N－和O连接的两种糖基化，这与哺乳动物细胞中发生的情况很相似。例如，人－α－1－抗胰蛋白酶(α－AT)，酵母细胞能像肝细胞一样地识别它，并把碳水化合物加到3个相同的天冬酰胺残基上，因而能被分泌到胞外，分泌的糖基化产物与天然的α－AT相同。酵母分泌的泡盛曲霉糖化酶、李氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶CBHI和EGI以及人粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(GM－CSF)，除有N－糖基化外，还有O－糖基化。但由于酵母的O－糖基化结构与哺乳动物的O－糖基化结构不同，不适于医用。有些蛋白还因外链碳水化合物(甘露糖)的加入而发生超糖基化。超糖基化蛋白本身虽不是酵母细胞胞外定位的屏障，也不影响离体生物活性，但由于有免疫原性而不适于医用。寄主菌株的倍体性对附加体质粒的有丝分裂稳定性和HBsAg基因的表达有明显的影响。例如，质粒YEp13、pYF91和YEp13+HBsAg在三倍体和大部分二倍体菌株中的有丝分裂稳定性明显高于单倍体菌株，大部分含YEp13+HBsAg和pNMVG3954的多倍体转化子、HBsAg蛋白的产量较单倍体菌株高2～4倍(Voropayava，1991)。发展适当的寄主菌株分泌突变体，可以改善酿酒酵母对某些不能以有效形式通过酵母分泌途径的异源蛋白的分泌水平。例如海能等(1989)报道，用mnn9突变体可减少外链加到α－AT或H1V衣壳糖蛋白gp120上。用蛋白酶缺陷型酵母表达人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t－PA)，可使提纯过程不受蛋白酶降解。利用酿酒酵母作异源基因表达寄主的研究虽然只有十几年的历史，但已充分显示出它的巨大生命力，已经有许多重要的医用蛋白可通过酿酒酵母进行生产，扩大酵母菌对碳源的利用也已取得突破性进展，直接应用粗淀粉和植物纤维素废物生产酒精、饮料酒和其它有用物质将可能变成现实。但是，利用酿酒酵母生产异源蛋白还有一些不足之处，例如，表达水平和分泌水平还不够高；某些蛋白在酵母细胞中的糖基化与哺乳动物细胞的不同，甚至产生超糖基化，会产生不希望的免疫反应而不适于医用。选择适当的寄主——载体组合、启动子、信号序列、转译后修饰和适当突变菌株，将有助于上述问题的解决。【参考文献】：1 Bitter G A. In Methods in Enzymology (Berger, S. L. , Ki-mmel. A. R.eds. ),San Diego:Academic Press, 1987,152: 673-6842 Cauni P, Impoolsup A.Greenfield P E.J Biotechnol , 1988. 8:173～1923 Cole G E.McCabe P C, Mow D.et al. Bio/Technol .1988. 6:417～4214 Barr P J, Brake A J.Valenzuda P(eds. ). Yeast Genetic Engineering. Boston-Butterworths, 1989.83:1085 Barr P J . Brake A J . Valenzuda P (eds. ). Yeast Genetic Engineering. Bosto:Butterworths, 1989.165 - 2806 Spencer J F T.Spencer D M. (eds. ). Yeast Technology Berlin:Springer-Verlag. 1990. 366-3867 Voropayava L A. Genetika (Moscow). 1991, 27: 114.3 ～1151(中国科学院微生物研究所陈玉梅副研究员撰) |