| 单词 | 根癌农杆菌介导的禾谷类作物的遗传转化 |
| 释义 | 【根癌农杆菌介导的禾谷类作物的遗传转化】 拼译：Cereal croptransformation medicited by Agrobacterium 根癌农杆菌是土壤中广泛存在的革兰氏阴性细菌，分类上属于根瘤菌科农杆菌属。人们早在20世纪40年代就认识到农杆菌可以通过伤口感染双子叶植物，并在感染处形成肿瘤即所谓冠瘿瘤，这种植物肿瘤(当诱导细菌不存在时)，具有激素合成的自主性，能够在普通植物组织生长的限定性培养基上扩增，并合成一种正常植物细胞中完全不存在的冠瘿瘤。当时，Braum等曾推测：农杆菌具有使双子叶植物细胞转化的能力。随着70年代以来基因克隆技术的兴起，这一推测很快地被证实，几个研究组几乎同时证明：农杆菌质粒(Ti)上有一段T-DNA被整合插入到宿主植物细胞基因组中，这种插入片段除了包含合成冠瘿碱的基因外，还编码合成生长素的1．2号基因和合成细胞分裂素的4号基因(统称为致瘤基因)，使被感染的植物细胞具有激素的自养能力，其生长素水平可高达正常细胞的500倍；细胞分裂素可高达正常细胞1600倍，使转化细胞失去正常的激素平衡，形成恶性增长的肿瘤组织。既然农杆菌能如此有效地将其T-DNA转入宿主细胞中并使之转化，人们很自然地想到要应用农杆菌作为载体进行植物转基因研究，以达到定向改良作物之目的(Schell等1977)，首先遇到的困难是农杆菌T-DNA上的致瘤基因(onc)能干扰转化的植物细胞内源激素平衡，使之成长为畸胎瘤而失去再生植物的能力；其次是农杆菌Ti质粒基因组太大(全长160～240kb)不利于遗传操作和引入外源目的基因，另外，T-DNA上还需要一个强有力的选择标记。自80年代以来，分子生物学家们集中全力对农杆菌Ti质粒进行了一系列的加工和改造(包括去除onc基因，插入选择标记等)，陆续构建了一批适合于双子叶植物细胞转化的基因工程载体，其中有共整合的单质粒载体系统、双质粒载体系统和拼接末端的载体系统等并分别把对植物细胞较为敏感的选择标记如NPT Ⅱ、DHFR、CAT、HPT等引入这类载体中，以实现对转化细胞的有效筛选。 令人遗憾的是农杆菌的宿主范围还仅仅限于双子叶植物和为数极少的单子叶植物，而对绝大多数单子叶植物尤其是关系国计民生之大的禾谷类作物则不甚敏感，这就限制了农杆菌介导的遗传转化在这类重要植物改良上的应用。农杆菌对禾谷类作物难以感染的原因何在，如何能够克服所存在的障碍，使这种方便有效的转基因系统在禾谷作物遗传改良上得以应用，已成为植物分子生物学家普遍关注并为之努力的重要研究领域。根癌农杆菌感染敏感植物细胞大体包括两个连续的过程，首先，农杆菌通过植物伤口和宿主细胞接触，并有效地附着结合到宿主细胞上，然后，受伤的植物细胞通过分泌或释放一种可扩散的信号物质(如AS或HO-AS)活化农杆菌的Vir基因，并诱导其顺次表达，进而对T-DNA酶切、环化、运载并插入宿主细胞的基因组中，完成整个转基因过程。接着，转化的宿主细胞分生、分化、并长成转基因植株。不少研究者认为，由于禾谷类作物细胞表面，可供农杆菌识别并与之产生特异性结合的位点缺乏或不足(或处于不暴露的遮盖和结合态)，使得农杆菌不能足量而有效地附着并结合到这类植物细胞表面，从而限制了农杆菌Ti质粒上的TDNA向这类植物细胞中转移ki等1978，Matthysse等1982，Gurlitz等1987)。另一部分研究者认为：农杆菌能够对禾谷类作物细胞形成有效地附着与结合(Douglas1985，Grave等1988)，主要是由于禾谷类作物细胞内缺乏一种可溶性信号物质或含量不足，不能有效地诱导农杆菌Vir区基因的活化，从而阻碍着其T-strand的形成和向宿主细胞中转移(Usami等1987)。而Potrykus等(1990)则认为根癌农杆菌可以有效地将其T-DNA转移到禾谷类作物细胞中，但由于受体细胞的死亡，这种T-DNA的个别整合却不能导致转基因克隆的形成，即是说禾谷类作物细胞对创伤引起的愈伤化反应很弱，不能形成同时具备再生和整合两种潜能的受体细胞，或不能使这种潜能变成现实。上述三种看法各有一定的理论依据和实验基础，但又似乎都还不能圆满解释目前已经得到的实验实事，深入剖析这三种可能存在的障碍，对我们全面认识农杆菌与禾谷类作物细胞相互作用关系，揭示转化障碍的本质和成因乃至发现和寻找合适的解决途径，都将是大有裨益的。根癌农杆菌能否有效地附着在宿主细胞上是实现转化的先决条件。大量的实验证明：在植物细胞壁上存在着可供农杆菌附着的结合位点，在农杆菌外膜上也存在有相应的识别位点。植物细胞上的结合位点是由一类特异的蛋白质和果胶类物质和多聚半乳糖醛酸(PGA)组成，细菌的识别位点则主要由一类膜蛋白和脂多糖(LPS)构成。根癌农杆菌附着宿主植物细胞的大体过程是：由受伤的宿主细胞分泌或渗漏的氨基酸和多糖类物质，刺激农杆菌的趋化性泳动，使菌体和宿主细胞得以接近，然后细胞外膜上的识别部位与宿主细胞表面的结合部位可能借助于静电引力而紧密接触，进而，附着于植物细胞上的农杆菌能很快长出纤维丝，“勾”在植物细胞壁上，形成牢固的结合。有不少实验指出：在相同条件下，农杆菌对禾谷类作物细胞附着明显少于其对敏感作物烟草、胡萝卜细胞的附着，从对悬浮培养细胞的实验的资料看，其差异可相差几倍到十几倍(Ohyama等1979，Matthysse等1982，杨剑波等1991)，造成这种差异的原因可能有两个，一是禾谷类作物细胞表面可供农杆菌识别并与之结合的位点数量较少；二是禾谷类作物细胞表面的结合位点处于不易暴露的遮盖态或结合态，支持第一种成因的证据是：构成结合位点重要成份的果胶类物质(PGA)在禾谷类作物细胞壁中含量只有双子叶植物的十分之一，甚至更少些(Cooper等1988)。支持第二种成因的证据是：用能切断多聚半乳糖醛酸a－1．4糖苷糖的果胶酶，短时间地处理禾谷类作物细胞壁，使PGA聚合物形成更多的外露接点，能大大改善农杆菌的附着(杨剑波等1992)。最近，也有不少实验结果对禾谷类作物可能存在的农杆菌附着障碍提出疑异，认为农杆菌对双子叶植物细胞附着与对禾谷类作物细胞的附着并没有明显的差异，并以确切的事实证明：农杆菌不仅能大量附着竹子的悬浮培养细胞、玉米和小麦发芽4～6d的幼茎切段，并且还能象附着双子叶植物细胞一样，形成大量的纤维丝，牢牢地结合到这类细胞的外壁上(Douglas等1985，Graves等1988)。上述两种截然相反的实验事实如果都是真实可靠的，这就很自然的揭示我们：农杆菌的附着可能不仅仅与植物种类有关，似乎与其细胞的年龄、类型、生理状态、分化发育进程关系更为密切。事实上，Matthysse等早就曾经证实：农杆菌虽能大量附着在高度愈伤化的胡萝卜培养细胞上，却很难附着在胚状体细胞上。杨剑波等的实验也指出：农杆菌对旺盛生长、高度分散的禾谷类悬浮细胞的附着远比对生长缓慢、僵硬老化的细胞系的附着来的多(杨剑波等1992)。显然，老化的、衰败的或高度特化的细胞都不利于农杆菌的附着，而那些年轻、幼嫩和保持旺盛分生活性的细胞则有利于农杆菌的附着，由于禾谷类作物细胞通常保持分生活性的时间很短，随后即迅速分化成不同类型的特化细胞，加之，他们对创伤所引起的脱分化反应很弱，这很可能是禾谷类作物细胞通常不能大量被农杆菌附着的重要原因之一。当然，共培养的环境条件(如温度、压力、pH、介质及添加物)也是影响农杆菌对植物细胞附着的重要因素之一，不利的环境条件，如温度的过高或过低、价质pH的过酸或过碱，都能显著地影响农杆菌对植物培养细胞的附着数量(Ohyama等，1979)，而适当抽气减压处理或是在培养介质中添加对农杆菌表现有强烈趋化性物质如氨精酸等，则有利于农杆菌对植物培养细胞的附着(杨剑波等，1992)。受伤的宿主植物细胞释放的信号物质是农杆菌Vir基因得以诱导活化的基础。Stachel等(1985)首先证明双子叶模式植物烟草中所含的Vir诱导活性物质为乙酰丁香酮类物质(AS或HO-AS)，Bolton等(1985)进一步用Vir：Lacz融合系统检测40多种多酚类物质，发现其中7种(儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮)可以诱导农杆菌Vir基因的活化，诱导活化的过程是：植物伤口释放的酚类信号物质和位于细菌膜上的植物信号的感受蛋白(VirA的基因产物)作用，从而诱发VirG基因的活化和高水平表达Vir基因的产物又启动和活化其它Vir基因的表达(VirB、VirC、VirD、VirE等)，其中由VirD基因编码的特异识别T-DNA边界序列的内切酶完成对农杆菌T-DNA的切割，形成单链的TStrands，进而和VirE编码的具有运载功能蛋白形成复合物后，在其它Vir基因的协同作用下，T-DNA被转运并插入到宿主细胞的基因组中，从而完成整个转基因过程。Usami等(1987)首次用PTMA系统(即在卡那霉素基因的启动子区和编码区之间插入T-DNA碱基顺序，当T-DNA的酶切和环化，进而推断：禾谷类作物中缺少能诱导Vir基因活化的可扩散性的信号物质。我们曾以农杆菌较易感染的双子叶植物烟草和胡萝卜为对照，检测了主要禾谷类作物中所含与农杆菌Vir基因活化诱导有关的酚类信号物质，发现无论是在种类还是数量上，其信号物质都较双子叶模式植物烟草和胡萝卜为少，其中水稻、大麦中含量最低(每克鲜重幼苗信号物质的含量均在6μg以下)，玉米和小麦中的含量稍高(大约在20μg／gFW左右)。被检测的主要禾谷类作物所含酚类信号物质的种类仅有1～2种；而烟草中含有5种不同种类的信号物质，其总含量为水稻和大麦的十几倍；胡萝卜仅次于烟草。从总体上看，不同作物所含酚类信号物的种类与数量分布与其被农杆菌感染的难易程度有着较好的一致性。此外，我们还发现同一作物不同品种和组织中所酚类信号物质的数量有明显的差异(杨剑波等1992)。Strange等(1992)曾用8个澳大利亚小麦品种的幼苗浸出物分别诱导根瘤菌NRG234菌株，发现不同小麦品种对nodDI基因(该基因能够被酚类信号物质活化)的活化诱导能力有明显差别。Raineri等(1990)在广泛筛选水稻品种的基础上，发现其中的两个品种对农杆菌染有明显的反应。从目前农杆菌介导的水稻遗传转化仅有的几个成功例证看，都是通过旺盛生长的愈伤组织而实现转化的(李宝健等1990，Raineri等1990)。以上的证据可以说明：禾谷类作物中虽然所含的信号物质相对较少，影响着农杆菌介导的遗传转化，但只要我们大量筛选品种，选择合适的宿主组织就能够被克服这种障碍，实现正常的转化。况且由于活性酚类信号物质被分析和鉴定，人们能够通过对农杆菌事先进行预活化处理，来弥补禾谷类作物细胞中含量不足的缺限。最近，Sahi等(1990)的研究结果说明还有另一种情况，他们发现玉米幼苗的匀浆可抑制根癌农杆菌的生长和为乙酰丁香酮所诱导的Vir基因的表达，并已由这种匀浆物中分离到一种热不稳定的抑制物DIMBOA，它是玉米产生的一种抗微生物的代谢产物，在二周龄的幼苗中浓度可达1．5mmol／L以上，而0．3mmol／L即足以抑制农杆菌生长达220小时，0．1mmol／L可完全抑制Vir 区基因的表达。目前还不知道其它禾谷类作物是否也存在着这种抑制物。Potryus(1990)认为：根癌农杆菌可以有效地将其T-DNA转移到禾谷类作物细胞中(这里一个最著名的例子就是1987年美国科学家将玉米病毒基因嵌入农杆菌载体的T-DNA中，通过细胞转化产生了系统的病毒浸染)，并且也有可能发生个别的TDNA的整合(因为以禾谷类作物原生质为受体的PEG或电击法介导的直接外源基因的导入，可以发生整合并得到转基因植物株就是一个证明)，问题是这种个别的整合却不能导致转基因克隆的形成，他进一步解释说由于禾谷类作物细胞对创伤引起的愈伤化反应很弱，不能形成同时具备再生和整合两种潜能的受体细胞．或不能使这种潜能变为现实。我们认为这种现象对直接用外植体进行农杆菌的转化肯定是存在的，但对培养细胞来说应该是不成太大问题，尤其对来自禾谷类作物的幼穗，幼胚的胚性培养细胞更是如此，因为胚性培养细胞的再生和整合潜能，已经为许多实验所证实。据于上述资料分析，不难看出，禾谷类作物虽然存在着农杆菌介导转化的障碍，但这种障碍是能够克服的。这一点将会被愈来愈多的事实所证明，我们最近用水稻和玉米的胚性悬浮培养细胞为材料，经果胶酶的短暂处理后，在抽气减压的条件下，与事先用乙酰丁香酮活化预处理的农杆菌共培养，经筛选、分化，最后得到了转基因植株(杨剑波等，1992)。尽管转化的频率较之双子叶模式植物烟草明显为低，在抗性标记筛选上也还存在着缺陷，但这无疑是一个良好的开端。【参考文献】：1 杨剑波，等．主要禾谷类作物所含酚类信号物质的分析．植物生理学报．1992，18(2)：64～692 杨剑波，等．影响农杆菌附着禾谷类作物细胞因素的研究，国家重点实验室年报．1990，163 Gurlitz，et al．Plant Physiol．1987，83：564～5684 Golgowske，et al．Plant Physiol．1987，61：1031～10335 Matthy，et al．Plant Pathology．1978，21：381～3876 Douglas，et al．Bacteriol．1985，161：764～7667 Graves，et al．Bacteriol．1988，170：2395～24008 Mooney，et al．Plant Cell Tlss．Org．Culture．1990，25：199～2089 Usami，et al，Mol．Gen．Gent．1987，209：221～22610 Potrykus，et al．Anmu．Rev．Plant Physiol．Mol．Biol．1991，42：205．22511 Raineri，et al．Bio／Tech，1990，8：33～3812 李宝健，等．中国科学B辑．1990，2：144～14913 Sahi，et al．PNAS．1990，87：3879(安徽省农业科学院杨剑波研究员、吴家道研究员撰) |
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