| 单词 | 核酸杂交技术 |
| 释义 | 【核酸杂交技术】 1957年华尼尔(Warner)等首先发现polyA(多聚A)与Polyu(多聚V)能形成稳定的双链结构，但当时未引起人们的重视。直到1960年多堤(Doty)等发现肺炎双球菌的双链DNA可以通过物理的方法解离成2条单链，又要再聚合形成双链。这才使斯匹捷尔曼(Spiegelman)等按照氢键作用原理创建了核酸杂交技术。在此之前，人们对大分子核酸只能进行浮力密度、稀有碱基、碱基组成、Tm值、感染力等特性测定。核酸杂交技术的建立，在核酸的研究领域内，增添了一个有力的分析和制备工具。已发展成为一项纯化特异核酸片段，比较核酸顺序，测定转录水平和研究基因表达的重要技术。在基因工程领域中，对重组DNA的检测，DNA重组载体的筛选和鉴定等，是一项极重要的技术。 1．核酸杂交液相杂交的进展：液相法是斯匹捷尔曼(Spiegelman)等最先使用的一种核酸杂交方法。他们把DNA和互补的RNA混合在溶液中进行杂交反应，然后用氯化铯平衡密度梯度离心法分离出杂交链。由于在反应中会形成一些非互补的双链称为“端”和“环”。因而测定结果不太准确。后来作者加用RNase处理杂交后的混合物，结果降解了“端”和“环”，增加了杂交反应的特异性。1963年哈尔(Hall)等发现硝酸纤维素滤膜对单链DNA和DNA：RNA杂交链有特异的吸附能力，从而用滤膜过滤法取代了费时的氯化铯超离心法。但是在进行液相法DNA／RNA杂交时，DNA的再聚反应将使单链DNA的浓度下降，不利于DNA：RNA杂交链的形成。1971年斯西巴尔史(Szybalshi)等用不相互补的DNA单链来进行DNA／RNA杂交，克服了DNA再聚的缺点。同时又发挥了液相法中分子碰撞几率大，杂交反应时间短，产率高等优点，使液相法有了新的发展。2．固相杂交的进展：1963年尼格尔德(Nygaard)和哈尔(Hall)在研究RNA：DNA杂种分子时，发现存在于氯化钾溶液中的变性DNA(单链)和RNA：DNA杂种分子，通过滤膜时能被滤膜吸收，变性DNA的吸收率达90%以上。而未与DNA杂交的RNA以及天然的未变性DNA，则不被滤膜吸收。1965年吉利斯匹(Gillespie)等利用这一现象，设计了在滤膜上进行DNA／RNA杂交的方法。随后登哈德(Denhardt)又将此项技术引进到DNA／DNA杂交研究中。在滤膜上杂交操作的一般步骤是，溶解在盐溶液中的DNA经过加热或使用碱液变性之后，在预先经盐溶液浸泡洗涤过的滤膜上滤过。变性的DNA便吸收到滤膜上。洗涤滤膜，经过室温干燥之后，再真空加热至80℃进一步干燥。将此滤膜浸入含有放射性同位素标记的已变性的探针DNA混合液中，在保温下进行杂交，反应完毕，充分洗涤滤膜，干燥后计数测定或用放射自显影检查结果。滤膜上杂交遇到地最大问题，是在杂交反应时，一些未与滤膜上DNA杂交的探针DNA，也被滤膜吸收，造成本底过高导致结果不可靠。为尽可能减少探针DNA非杂交的吸收在滤膜上，采取了下列措施：(1)处理滤膜：在杂交反应之前，将已含有DNA的滤膜先浸入登哈德(Denhardt)(由聚蔗糖、聚乙烯吡咯酮、牛血清白蛋和盐溶液配制而成)溶液中，在65℃保温6h，经过这样处理的滤膜，本底可由原来的80%降低至0．64%，而且对杂交反应影响不大。(20使用合适的杂交反应溶液，以期达到尽量减少本底又不妨碍杂交反应的目的，狄马利(Demare)在对探针DNA的2×SSC(0．3mol／L氯化钠、0．03mol／L柠檬酸三钠)杂交溶液中，加入终浓度为30%的二甲亚砜，再以此溶液洗涤杂交后的滤膜，本底可降低至0．4%，达卫德(Dawid)将终浓度为50%甲酰胺加至杂交反应溶液中，并用50%甲亚酰胺的2×SSC溶液洗涤滤膜，本底可降低至0．01%，杂交反应温度由原来的65℃降低至37℃。库利尔斯基(KourilsKy)使用含8mol／L尿素或50%甲酰胺的2×SSC溶液，于40℃进行杂交反应也取得良好效果。(3)用合适的溶液洗涤杂交后的滤膜，除了上述用含有二甲亚砜或甲酰胺的溶液洗涤外，华尔纳尔(Warrnaar)还采用低离子强度，低H+浓度溶液(3×10－3mol／LTris－HCl3．98×10－10mol／L)洗涤滤膜，本底降至0．004%。3．杂交作用方式的进展：(1)饱和杂交和竞争杂交：两者都建立于1962年，前者是固定了DNA的用量，然后逐渐加大互补RNA的用量而进行的一系列杂交反应。当RNA用量加大到杂交链不再增加时，就过到饱和。后者是采用2种不同标记的RNA来竞争同～DNA。先固定DNA和第1种标记RNA的用量，然后加入用量逐渐增大的第2种RNA，从第2种RNA对第1种标记RNA的取代与否，可以判别2种RNA的顺序是否相同。(2)预饱和竞争杂交：1967年卡色(Kasai)等用固定量的DNA滤膜，先和一系列用量渐增的未标记RNA作用，使达饱和。然后在各张滤膜上再加入足以饱和DNA的定量标记RNA来竞争。此法的分辨力比竞争杂交强。(3)彻底杂交：按1968年斯捷匹尔曼(Spiegelman)所述用固定量的RNA和一系列不同量的DNA滤膜杂交，在某－DNA量下，杂交反应不再增加就达到了彻底杂交。(4)夹心式杂交：1968年福吉纳格(Fujenaga)选用未标记的RNA饱和DNA滤膜，再加入同种标记的DNA进行再聚。从标记DNA与固化在滤膜上DNA的再聚量，即可知RNA的杂交量。(5)多步杂交：1971年波弗瑞(Bovre)等推广应用，这一技术是成功地将放射性标记的RNA，从各种杂交链的DNA不洗脱下来，然后再重新与DNA杂交。如此反复多步杂交即可增加核酸杂交的特异性，但操作较繁琐。(6)PolyA杂交：已知哺乳动物mRNA、HnRNA均具有pooyA顺序。1969年爱狄门茨(Edmonds)等利用这一特征发展了PolyA杂交法，这一方法对纯化、测定mRNA有独特的功效。(7)连续杂交：1973年施赫(Shih)等用固化RNA的纤维柱来提取相应的DNA。由于DNA是液相的，它的自身聚反应降低了DNA与RNA的杂交效率。作者使用了一个封闭的装置，使从RNA纤维素上流出的再聚比链DNA的另一根变性柱中，再解聚成单链。然后重新被压回到RNA纤维素柱上进行反应。这种连续杂交既能使40－50%的相应DNA形成杂交链，又具有高度的特异性，是纯化基因的一种方法。(8)DNA印迹转移杂交(SouthernHybridizstion)：基因组DNA经限制性内切酶消化后，用琼脂糖凝胶电泳分离的DNA片段变性，然后转移至硝酸纤维膜上并固定之，DNA片段在凝胶中的相互位置仍保留在滤膜上。用32P－标记的DNA或RNA与固着在滤膜上的DNA杂交，然后用放射自显影术确定探针互补序列的位置，即所要定位的DNA序列的位置。Southern转移技术不仅通用于确定特定序列在克隆DNA中的位置，也能用于鉴别真核基因组DNA消化物中的特定序列，适用于对基因组DNA和DNA克降片段的分离和纯化。(9)RNA印迹转移杂交(Northern Hybridization)分离纯化的RNA，用琼脂糖凝胶电泳分离RNA，已变性的RNA，按Nouthern转移技术，将RNA转移到硝酸纤维膜上并固定之，用32P－标记的DNA或RNA探针与固着在滤膜上的RNA杂交，然后用放射自显影检测探针互补的RNA序列。(10)点杂交(DotHybridization)：1979年卡发多斯(Kafatos)等将纯化的小量RNA样本点到干燥的硝酸纤维滤膜上，干燥固定后，用32P－标记的DNA或RNA探针杂交，经放射自显影确定杂交的结果。(11)原位杂交：1967年弗兰迟(French)等首先在细胞水平上建立了原位杂交技术。他们把细胞染色体固定在载玻片上，与氚标记的互补DNA杂交，然后用放射自显影法对杂交位置做出鉴定。原位杂交技术，最初用来确定许多物种基因组内大量重复序列在染色体上的位置，随着技术的发展，成为研究基因在细胞核内的空间组编方式，及其在分化和发育过程中作用和表达方式等重要课题的有效手段。在染色体上基因定位的研究中，另一种重要改进是把染色体分带技术与原位杂交技术结合使用。这些方法，包括用胰蛋白酶或1%Lipsol去垢剂处理后把姬姆萨分带的染色体预先拍照，或者在杂交反应以后用喹吖因芥子将染色体染色以获得Q带。此外，在杂交和放射自显影以后只要用瑞氏－姬姆萨染色，总能在中期染色体得到G带图。在电子显微镜下进行观察时可用带胶体金标记的过氧化氢酶或蛋白质处理杂交探针，得到极高的空间分辨率。该方法的应用，使人们能更准确的测定基因及其转录产物在染色体上的确切位置。用电镜法研究细胞或组织块连续超簿切片的杂交图象，将为构筑特异DNA序列在单个细胞内组编方式的三维图像提供可能。【参考文献】：1 Nygaard A P,et al. J. Mol. Biol,1964.9:1252 Gillespie D,et al. J. Mol. Biol, 1965,12 : 8293 Denhardt D T Biochem,Biophys,Res COmm,1966,23:6414 Southern EJ Mol,biol. 1975,98:5035 Thomas P S Proc. Natl. Acad. Sci 1980,77:52016 While B A and F c Bancroft. J. Biol. Chen. 1982,257:85697 Kafatos F C et al. Nucleis Acids Res. 1979,7:1541(中山医科大学杨英浩撰) |
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