| 单词 | 水稻原生质体培养 |
| 释义 | 【水稻原生质体培养】 植物原生质体即去掉细胞壁的裸露植物细胞，它具有“全能性”，通过离体培养可以得到原生质体再生植株。植物原生质体再生为作物的体细胞杂交、基因转移和体细胞无性系变异的应用，以培育抗病虫、抗逆、优质、高产作物新品种提供了极为有利的体系；同时为一些基础学科如体细胞遗传学、细胞学以及细胞生理学等研究提供了新手段。 水稻原生质体培养一直引人关注。1975年中国科学院北京植物研究所细胞杂交组及细胞生化组获得了粳稻原生质体形成的细胞团，这是国内外最早在水稻原生质体培养上取得进展的报道。1978年他们(蔡起贵等)用同一材料进一步试验，获得了愈伤组织。1976年迪卡(P．C．Deka)等也报道了由水稻原生质体形成愈伤组织并分化出根。此后6～7年间，水稻原生质体培养，一直未见成功的报道。1984年瓦卡萨(K．Wakasa)等发现AA培养基有利于水稻细胞悬浮培养物的建立，并由其游离的原生质体形成愈伤组织。这种培养基以后被许多实验室所采用，从而推动了研究工作的进展。1985年日本藤村(T．Fujimura)等在国际上首次报道由粳稻原生质体再生出小植株。随后法国、中国、英国、美国等国的科学家相继报道了水稻原生质体再生成株。至今，在国内外已有近30家实验室获得成功，这是在禾谷类作物原生质体培养方面取得的重大进展。应当着重指出的是，英国诺丁汉大学植物遗传操作实验室，于1986年建立了较稳定的水稻原生质体培养程序，特别是采用热击处理和琼脂糖包埋法等，为这一领域的发展作出了贡献。笔者试图将水稻原生质体培养技术，能尽早的与常规育种结合起来，选用了不同基因型的材料，已将20余个生产上有价值的水稻品种或品系建成悬浮细胞系，其中有10多个材料(包括粳稻、籼稻、野生稻；广亲和系、恢复系及不育系等)已能从原生质体再生成株，并建立了水稻原生质体快速、高效成株技术体系。水稻原生质体培养的主要程序：(1)愈伤组织的诱导：以成熟胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶等为起始材料，在含2，4－D的MS、LS、AA或N6固体培养基上诱导出愈伤组织，经继代培养后，从中挑选胚性愈伤组织，可用于悬浮培养或直接用来游离原生质体。(2)悬浮细胞系的建立：从刚诱导出来的或经继代培养后的愈伤组织中，挑选生长快、呈颗粒状的、淡黄色的胚性愈伤组织，在AA液体培养基中进行振荡培养，每周至少继代一次，约3～4月后可建立起分散性好、色泽鲜黄、具有旺盛分裂能力的悬浮细胞系。(3)原生质体的分离：将转代后生长3～5d的悬浮细胞或转代后7～8d的愈伤组织，用混合酶液游离原生质体。酶液组成为2%纤维素酶(Cellulase Onozuka RS)、0．05%离析软化酶(Pectolyase Y－23)、5mmol／L MES、CPW盐及13%甘露醇，H+浓度2．5μmol／L。在27℃黑暗条件下，置于摇床上(35r／min)孵育3h，静置2h。原生质体－酶混合液先后用45μm和30μm的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体，并用含CPW盐的13%甘露醇溶液清洗两次，最后用KPR原生质体培养基洗一次。(4)原生质体培养：将原生质体悬浮在KPR培养基中，在45℃水浴中热击处理5min，接着在冰水中冷却10s，原生质体与含有1．2%低融点琼脂糖的KPR培养基等量混合，以每毫升(0．5～1)×106原生质体的密度接种于直径3．5cm的玻璃培养皿中，每皿接0．3～0．4ml，用蜡带(Parafilm)封口，培养物放在26±1℃下暗培养。2～3d后，把埋有原生质体的琼脂糖分割成4～6块，并加入0．3～0．5mlKPR液体培养基；此时，大多数原生质体体积增大，有的变成卵圆形，这表明原生质体已形成了细胞壁。培养5～8d后，由原生质体再生的细胞进行第1次分裂和第2次分裂；此时，可以统计再生细胞的分裂频率。再生细胞一旦分裂以后，要适时地加入降低渗透压的KR培养基，这样便能持续地分裂下去。当原生质体再生的细胞分裂形成16～32个细胞的小细胞团时，应及时添加降低渗透压的，并适当提高2，4－D浓度的液体培养基1～2次，此后原生质体再生的细胞能朝着形成胚性细胞团的方向发育。(5)植株再生：当原生质体再生的细胞分裂形成大细胞团或肉眼可见的小愈伤组织时，可将它们适时的转移到含6－苄基氨基嘌呤(6－BA)、激动素(KT)和萘乙酸(NAA)的N6固体分化培养基上，此后胚性愈伤组织或胚性细胞团逐渐发育成胚状体，约两周左右开始分化出胚芽鞘，进而长成带根的小植株。按照上述培养程序，笔者已实现了5个水稻品种(或品系)原生质体快速成株，即从原生质体分离到再生出小植株的过程仅用37d时间，而目前国内外其他实验室完成这一过程至少要2～3个月。快速成株体系的建立，以保证从原生质体再生出来的幼苗能与常规育种同步种植，使再生植株能在自然条件下生长，并进行鉴定，以便选出育种上有价值的材料。通过胚状体发育的途径，不仅大大缩短了成株的时间，而且已能使原生质体植株再生频率提高到0．05%～0．1%(以培养后成活原生质体数计算)。(6)再生植株的移栽：这是一项值得重视的技术。按照笔者的经验，在11～12月份以后再生出来的小植株，由于气温逐渐下降，不宜移栽到土壤中。若将小植株保留在试管中，在室温(10～15℃)自然光照条件下越冬，通常可达4～5个月之久，期间视培养基的消耗程度，可适当加入液体培养基1～2次，待翌年4～5月春暖花开时，可将小植株移栽到土壤中，移栽成活率右达90%～95%。水稻原生质体培养的研究，虽已有不少成功的报道，但仍存在植株再生频率较低的难题；因此，改进和完善培养技术，建立高效成株体系，是当前急待解决的技术关键之一。粳稻原生质体较籼稻易获得再生植株；因此，扩大基因型(特别是籼型)的研究是十分重要的。由悬浮细胞的原生质体培养成株的实验体系，已逐步趋向完善，这为外源遗传物质导入水稻原生质体奠定了良好的基础；而由器官(如叶片等)的原生质体培养成株的实验体系，尚未建立起来，因此，加强这方面的基础研究是十分必要的，一旦获得成功，将会大大简化程序，并推进这一技术早日用于水稻品种的改良。【参考文献】：1 Wakasa K，et al．Colong formation from protoplasts of nitrate reducase different rice cell lines．J．Plant Physiol．1984，117：223～2312 Fujimura T，et al．Regemeration of rice plants from protoplasts．Plant Tissue Culture Letters．1985，2：74～753 Abdullah R，et al．Efficient plant regeneration from rice protoplasts through somatic embryogenesis．Bio／technology，1986，4：1087～10904 颜秋生、张雪琴．水稻原生质体培养．农作物组织培养．颜昌敬主编．上海：上海科学技术出版社，1991．129～134(中国水稻研究所颜秋生、张雪琴撰) |
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