【共生固氮放线菌】
拼译：frankia
它是与非豆科植物共生形成根瘤并固定空气中的氮素，可供植物营养的一类放线菌，属放线菌目，弗兰克氏菌科，弗兰克氏菌属。1866年，Woronin描述了欧洲赤杨根瘤内有内生菌。1955年，Bond用植物试验和同位素N氮技术证明在非豆科植物中的赤杨、杨梅、胡颓子和沙棘属植物有固定大气氮素的功能。1961年，Becking用电子显微镜研究了欧洲赤杨根瘤的内生菌，证明为放线菌并命名为弗兰克氏菌属(Frankia)。经Bond的介导，国际生物规划(IBP)1967～1976年开展了全球性的非豆科植物资源调查，发现有13个属157个种的植物有结瘤固氮作用。但由于技术上的原因，在长达数十年的时间里未能从它们的根瘤中获得其内生菌的离体培养物，研究工作受阻。直至1978年Callaham才获得突破性的进展，首次从香蕨木根瘤中人离出内生菌的纯培养物，从此开展了微生物学研究发展的阶段，成为生物固氮研究中的一个活跃领域。生产上的需要、理论上的求索和新技术的应用更促进此项研究的蓬勃发展。
资源 弗兰克氏菌与非豆科植物的共生有其特定的寄主范围，它仅与木本双子叶植物共生结瘤固氮，这类植物亦称放线菌结瘤植物。目前全选举有8科23属223种植物有共生固氮的放线菌根瘤，中国有5科6属46种植物有共生固氮的放线菌根瘤。放线菌结瘤植物固氮力强、分布广、适应性强，在各种生态条件下都能生长。它们主要分布在南温带的北温带地区，个别植物和木麻黄科植物也延伸到亚热带地区。从江河、湖塘和沼泽地萄潮湿环境，到沙丘甚至沙漠的干旱环境，从海岸地区到高海拔地区都有它们的存在。放线菌结瘤植物在绿化造林、恢复植被、改良土壤和改善生态环境上起着重大作用，而弗兰克氏菌的广阔的寄生范围、跨越科属的侵染特性更是遗传工程研究的理想材料，它的研究有着诱人的前景。弗兰克氏力的分离技术 1978年，Callaham首先突破了分离此内生菌的困难，从香蕨木根瘤中分离出弗兰克氏菌的离体纯培物，并经回接试验证明为真正的共生固氮放线菌。酶处理法、蔗糖梯度离心法和根瘤切片等方法均是分离此菌的成功技术。现已从8个属50个放线菌结瘤树种中分离出弗兰克氏菌。中国已从5个属34个放线菌结瘤树种中分离出弗兰克氏菌。形态 菌丝有分枝和横膈，直径0．6μm，不形成气生菌丝。菌丝体在液体培养基中发育良好，在固体培养基中生长缓慢，属微好气性。在菌丝体上形成孢子囊。孢子囊形状多样，如菠萝形、梨形、球形等；大小不一，小的约30μm，大的可达100μm。孢子囊内含有孢子。孢子不具鞭毛、不游动。众多孢子由于在囊内相互挤压，多呈不规则的多面体，直径1．5～2．0μm。在无氮培养基中形成大量球形顶囊(vesicle)，直径2．2～4．1μm，着生于顶囊柄上。生理 它能很好地利用乙酸钠、丙酸钠和丙酮酸钠为碳源，很少利用糖醇类。酪蛋白水解物和NH4CL是良好的氮源。代谢 顶囊是发生固氮作用的部位。顶囊固氮形成的NH4+转移到菌丝中经谷酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)同化成谷氨酰胺(GLN)和谷氨酸(GLU)，进入有机联体，再供菌体代谢。在宿主根瘤中，顶囊将固定的氮素分泌到宿主细胞中，并由宿主细胞的谷氨酸脱氢酶(GDH)或谷酰胺合成酶(GS)，将
同化成谷氨酸(GLU)和谷氨酰胺(GLN)，然后在转氨酶的作用下合成其他氨基酸和酰胺类物质，以酰胺或酰脲类有机氮化物为主要形成由根瘤输出，运向根、茎、叶，供作氮素营养。分类 已从8个属放线菌结瘤植物的根瘤中分离出一大批内生菌的离体培养物。为明确它们的分类地位和建立合理的分类系统，进行了大量的研究工作，对弗兰克氏属的描述已有6条标准：(1)分离出来的菌株应具有侵染原宿主、结瘤的能力；(2)菌株应具有固氮活性；(3)菌株具有特宣誓形态特征，产生顶囊和孢子囊；(4)细胞糖中含有2－0methy1－D-mannose；(5)细胞壁Ⅲ型，革兰氏正反应，磷脂Ⅰ型；(6)G+C百分比高，范围为68%～72%。种的标准还待建立，但对属以下的划分已有许多方法，现择要列举如下：(1)寄主的亲和群。根据弗兰克氏菌的侵染特性，可将弗兰克菌划分为不同亲和群，作为菌株归群的标准。(2)nif基础因探针的利用。根据固氮酶结构基因在固氮微生物中的保守性，用肺炎克氏杆菌nifHOK为探针与酶切的弗兰克氏菌总DNA杂交，考察其基因组nif片断的分布、大小及相似性程度，根据nif片断的分布、大小及相似性程序而将不同亲和群的菌株区别开来。(3)蛋白和同功酶谱分析。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究菌体全细胞可溶性蛋白和同功酶谱。根据图间的相似性了解各菌株间的亲缘关系。此法简便、灵敏，特别适于近亲缘关系的菌株间的鉴定。(4)核苷酶探针技术的利用。根据弗兰克氏菌16SrRNA的系列分析，可查明不同类群菌种中存在的特定系列。设计互补合成的寡核苷酸探针，用以探查不同菌种间的亲缘关系，利用此技术可将弗兰克氏菌和其他放线菌、弗兰克氏菌不同亲和群的菌株以及同一亲和群中的有效菌株和无效菌株区别开来。这是一种高效、灵敏的技术。(5)DNA-DNA杂交技术的利用。已将不同亲和群的弗兰克氏菌划分为9个基因种，但因缺少供鉴定用的表型检验，故无法定种。(6)16SrDNA序列扩增技术的利用。利用此技术已阐明弗兰克氏菌8个基因种的16S rDNA序列同源性和总DNA列同源性有很好的相关性，而各基因种均有其特定的序列。故此法不仅能对离体的弗兰克氏菌进行分类鉴定，还可用以探查根瘤中内生菌的分类地位，勿需先进行内生菌的分离。(7)16s－23s rDNA扩增技术的利用。此法特别适于远缘菌种间亲缘关系的研究，以把Frankia菌和non-Frankia菌区别开来。总之，微生物学研究和分子生物学研究的结合将会促进Frankia种的确定和Frankia分类系统的建立。生态 随着分子生物学的发展，一些高新技术已应用于弗兰克氏菌的研究，使弗兰克氏菌的生态研究获得突破性的进展，解决了在细胞水平研究上难以解决的问题。如马桑内生菌的研究，虽知根瘤中的内生菌为放线菌。在分离物中也看到菌丝和孢子囊的形态，但回接试验始终未获成功。而用16Sr RNA寡核苷酸分子探针技术已能确证其内生菌为弗兰克氏菌。分子探针技术的优点不仅在于对已分离出来的菌株能进行精确诊断，同时还能对一些未分离出来的根瘤中的内生菌和不能得到离体培养物的内生菌进行诊断。由于探针－靶系统的高度专一性，因此在土壤环境中或在混杂培养中，当仅有极少量的弗兰克氏菌存在时亦能探测出来。设计互补合成的寡核苷酸还可用分子标记以区分有效菌株和无效菌株，追踪弗兰克氏菌在土壤中的活动，研究接种菌株和土著菌株的竞争性等。遗传 由于弗兰克氏菌具有跨越科、属的侵染特性，因而被认为是研究扩大寄主范围、结瘤机制、固氮基因转移和构建新的固氮特种的理想材料。但此菌生物缓慢，在固体培养基上不易形成菌落，形态结构复杂，不同步生长，孢子萌发率低，致使弗兰克氏菌自身遗传系统还未建立起来，而是采用异源DNA探针技术来考察和克隆弗兰克氏菌的基因。根据固氮酶结构基因在固氮微生物中普遍保守性，用pSA30(含肺炎克氏杆菌nifHDK)为探针与BamHI酶解和弗兰克氏菌总DNA相杂交能检测出弗兰克氏菌中的类似基因，故有其同源性。用豌豆根瘤菌结瘤(nodDABC)为探针则不能与BamHI和EcoRI酶解的弗兰克氏菌DNA相交，说明弗兰克氏菌DNA与根瘤菌基因没有序列相似性。因此还需建立一个合适的克隆系统，用以研究共生基因。细胞融合研究的进展已为异源DNA导入弗兰克氏菌和将nod和nif基因导入放线菌中开辟了一条途径。应用与发展 (1)放线菌结瘤植物资源的利用在发展国民经济上已做出重大贡献。木麻黄、沙棘、赤杨的大规模栽培利用，已取得巨大的经济效益和生态效益，但还有大量的放线菌结瘤植物资源未很好开发利用，故发展潜力极大。(2)自然界中在放线菌结瘤植物的根系上常伴有菌根的侵染，形成三位一体的共生体系(trisymbiosis)。菌根的存在加强植物对磷和水分吸收，从而加强了共生体的固氮作用，促使植物旺盛生长。因此，应很好地利用这一现象，特别在缺磷和干旱地区的绿化造林更应注意此点。(3)生物工程技术的发展已可使外源基因导入弗兰克菌中和将nod基因和nif基因导入工程菌中，此将为理论研究和应用研究开拓广阔前景。(4)共生固氮机制的研究将为人类揭示此共生体系的奥秘，并对共生基因进行调控和利用，构建高效工程菌和构建新的共生体系。【参考文献】：1 Bond G，Symbiotic nitrogen Fixation in plants，1976，443～4742 Callaham D，et al．Science，1978，199：899～9023 Hahn D，et al．Plant and Soil，1989，118：211～2194 Pascal Simonet，et al．Molecular Biology of Symbioti Nitrogen Fixation，1990，77～1095 SylvieNazaret，et al．Journal ofBacteriology，1991，173：4072～40786 Pascal Simonet，et al．Applied and Environmental Microbiology，1991，11：3278～32867 Ding Jian，et al．The nitrogen Fixation and its Research in China，1992，556～566(中国科学院沈阳生态所丁鉴撰)