【兰花组织培养】
拼译：tissue culture of orchids
兰科植物是重要的观赏、药用及香料植物，全世界有660属25000种。为了保护兰花野生资源，快速繁殖优良品种，保护珍稀濒危种类及去掉病毒等，兰花的组织培养方法在其品种繁育方面已成为重要的手段。所谓组织培养，即利用兰科植物的根、茎、叶、花及未成熟胚等的组织或器官的一部分，于无菌条件下放置于事先配制的培养基上，在一定温度、光照条件下培养使其达到增殖的一种生物工程方法。
兰花的种子细微，没有胚乳或子叶，在自然界的萌发率不超过5%。1903年，伯纳德(Bernard)首先对兰花的根菌在种子发芽中所起的作用进行了研究。他从兰科植物根上分离得到真菌，将它们接种到卡特兰种子上使种子发芽，从而发现了在兰花中共生的真菌(菌根)与兰花种子萌芽的关系。1909年，伯吉夫(Burgeff)从兰花菌根分离出各种真菌，发现不同属的或不同种的兰花其菌根各不相同，只有相同种的或相近种的根菌存在，兰花的种子才能萌发。他们的实验证明，没有真菌的存在兰花种子就不能萌发。这些研究成果为以后兰花的试管培养奠定了基础。以后的研究资料又证明，兰花种子萌发不是直接被胚内的真菌诱导的，而是由真菌分泌的或是消化的产物促使种子萌发。1922年，努森(Kundson)在只含有糖及无机盐的简单培养基上就使兰花种子萌芽成功，第1次证明了在提供适当的营养、可溶性糖及适宜的pH值条件下，兰花种子不需真菌的协助也可以在人工无菌培养基上萌发。1946年，努森提出能更广泛应用于各属种兰花种子萌芽的Knudson c配方。Vacin和went(1949)提出了广泛用于兰花杂交种种子萌芽的培养基。现已有40种以上适于兰花种子萌芽的培养基。特别对一些难于萌芽的温带地生兰的种子无菌萌芽研究更为广泛。1981年，Henrich将15属29种地生兰播种在Norstog培养基补加维生素和氨基酸(用0．22μm筛孔漏斗过滤)的培养基上培养，6个月后有9属的16种发了芽。1983年，J．D．Chung用兰属地生兰在14种培养基上播种，确定了Tsuchiya和Nitsch微量元素，Kyoto Ⅱ和Nf-G优于其他培养基。1982～1985年，Nagashima对Cymbidium goeringii，Paphiopdeilum insigne变种，Phaius和Calanthe属的9个种的种子无菌萌芽确定了各个种的合适培养基。兰花无菌萌芽的成功使兰花杂交育种工作突飞猛进，杂交新品种层出不穷。种皮中存在着影响种子萌发的抑制物质，被认为是地生兰种子难以萌发的原因之一。1984年，H．W．Pritcard以液氮处理地生兰种子，提高萌发率25%。1988年，K．Miyoshi用超声波处理Calanthe种子，处理4～16min使种皮脱落，萌发率比对照提高50%。1984年，Yasugi用Doritis pulchersima受精前的胚珠培养，不但得到了植株，还缩短了整个生长发育周期，提前150d成熟。虽然无菌萌芽的研究很普遍，但仍有少数研究者致力于有菌萌芽的研究。Clement(1981)认为有些原生种无菌萌芽失败而在有菌培养中却能获得成功。如稀有濒危的Diuris属、Thelymitra属的种，有菌培养下不仅得到茁壮的幼苗，而且移栽容易成活，是无菌萌芽所不及的。1960年，法国莫勒尔(Morel)将带有Cymbidium镶嵌毒素病的兰花植株茎尖(0．1mm大小)在Knudsonc培养基上进行去病毒实验，数周后，培养的茎尖发育成类原球茎(PLB)，进而发育成无病毒植株。这是兰科植物生长点培养成功的首例。1963年，温勃尔(Wimber)用莫勒尔的方法取得兰花生长点并放在液体培养基中培养，发现生长点长出PLB后继续在液体培养基中培养，可以不断地产生新的PLB。1964年，莫勒尔在固体培养基上将由生长点诱导形成的PLB进行切割，每个PLB四等分，一个月后切口处又产生新的PLB，如此反复切割、培养，从理论上计算一个生长点每年可以产生400万个PLB。莫勒尔的方法开辟了试管内大量繁殖植物个体的可能性，促成了兰花工业化的大规模生产，成为组织培养应用于生产实践的先驱性工作。目前，除扩大可进行组织培养的兰科属、种外，还研究生长调节物质对兰花器官形成的影响。Kim(1982、1984、1988)研究了2．4－D、IAA、NAA、BA等对兰属植物杂交种和寒兰器官形成的影响，指出BA促进芽的形成，但5ppm则抑制根的形成。低浓度GA3促进PLB形成，而高浓度则抑制根的形成；同样，2．4－D在高浓度时会导至形成畸形根。同时指出，不同发育时期茎端的内源激素水平不同，具2枚叶原基时茎端的细胞的分裂素及ABA均低，4枚叶原基时细胞分裂素高。因此生长调节物质的最适浓度是随茎端叶原基数目而变化。采取植株主体部分以外的组织作为外植体，以减少对植株的损伤。其所进行的研究有：(1)花部：K．Zimmer(1978)用蝴蝶兰花茎上的休眠芽诱导形成小植株，将此小植株切割分段诱导PLB，1年可从单个休眠芽产生1000棵小植株。1984年，Singh用thunica alba(一种珍稀兰花)已开过花的花茎上的芽，在VW培养基上培养产生PLB，从一枝花茎获得400个PLB。Y．Homma(1985)、C．C．Lim(1987)用蝶兰花茎的节间，在Thomale G D培养基上培养100d，有50%～80%的外植体产生了PLB。G．Kerbany(1984)、K．Shimasaki(1991)分别从Oncidium和Cymbidium goeringii的幼嫩花芽诱导出PLB，并产生再生植株。(2)叶片：Champagment(1970)从卡特兰叶片基部得到愈伤组织和PLB。M．E．Churchill等人(1971、1973)从石斛、树兰和蕾丽卡特丽亚兰幼叶的叶尖部位得到愈伤组织和PLB。Vij(1984)、Tanaka(1985)分别在Rhynchostylis retusa和蝶兰叶片的切段切口处得到PLB，从组织学观察PLB的发生都是表皮起源的。(3)根：Button(1978)以树兰的根切段获得愈伤组织并再生植株。Phillip(1986)将香荚兰气生根切段置于MS培养基的滤纸桥上，产生了丛生芽并形成小植株。G．B．Kerbany(1984、1991)用Catasetum和卡德兰的根尖在改良Knudson培养基上诱导出愈伤组织和PLB。J．Holters和Zimmer(1990)以珍稀兰科植物Mormodes histrio的根尖在Knudson c加BA0．1～O．5ml／L和NAA0．1～0．2ml／L培养基上诱导出PLB，而在BA2ml／L和NAA0．2ml／L浓度的培养基上则诱导出芽。(4)单细胞培养：F．C．Stewart(1971)将兰属植物的体细胞在white培养基上培养，从单细胞诱导形成植株，并在移栽5年后开了花。茎端培养或其他营养体部分的组织培养能使优良个体得到增殖，但并不能得到新的遗传类型。杂交育种在兰花的品种更新及改良上起着重要的作用，但它也有一定的局限性，而利用原生质体融合(或称体细胞杂交)就可能克服远缘种属间杂交不亲和性或子代不育等常规远缘杂交所难以克服的障碍，培养出自然界不可能出现的新品种。同时原生质体也是遗传转化研究的一个理想的受体，它能直接摄取外源基因，因而可以有目的地引入特定的有用基因来改良兰花的品质。兰花原生质体培养工作最早始于C．K．Teo和K．H．Neumann(1978，a，b)用Renanthera的类原球茎在酶液中酶介，得到40%～60%有活力的原生质体，培养后形成4～6个细胞的细胞团。以后S．Yasugi等(1986)从石斛、
脊兰、树兰等的叶片分离得到70%～80%的原生质体。将石斛的原生质体在修改的MS+NAA2mg／L+BA0．5mg／L培养基上培养得到绿色的胚状体。现报道已有13属20种兰花可以分离出原生质体，但分离的原生质体没有再生成植株。60年代初兰花的组织培养取得了举世瞩目的进展。能够成功地进行组织培养兰科植物的属现已达到60个，有些种已达到试管生产的规模。但仍有些具观赏价值和经济价值的种，尤其是地生兰类的茎及其他组织的愈伤组织诱导及再生植株有待进一步研究。以改良兰花品质为目的的原生质体的培养和融合等兰花的细胞工程、基因工程等都将是今后研究的热点。【参考文献】：1 Morel G M．Amer．Orchid Soc．Bull，1964，33：473～4782 Arditti J，et al．Bot．Rev．1967，33：1～973 Rao A N．Applied and Fundamental Aspects of Plant cell tissue and organ culture，Berlin Heidelberg：Springer-Verlang，1977，52～574 Linden B．Ann．Bot．Fen．1980，17：174～1825 Tanaka M．Bull．Univ．Osaka Prefecture，B．1985，37：1～46 Nagashima T J．Japan Soc．Hort．Sci．1985，54：231～2417 Tanaka M，et al．Horticulturae，1988，35：117～1268 王熊，等．园艺学报，1988，15(2)：205～2089 孙安慈，任玲，王伏雄．植物学通报，1989，6(3)：147～15010 Yasugi S．Plant protoplasts and genetic engineering Berlin Heidelberg：Springer-Verlag，1989，235～253(中国科学院植物研究所孙安慈副研究员撰)