请输入您要查询的字词:

 

单词 应用PCR技术检测急性淋巴细胞白血病患儿体内的微小残留病
释义

【应用PCR技术检测急性淋巴细胞白血病患儿体内的微小残留病】
 

拼译:use of polymerase chain reaction(PCR)to monitor minimalresidual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia
 

小儿急性淋巴细胞白血病(急淋,ALL)应用联合化疗获得完全缓解后,体内仍残存着106~108个白血病细胞。此时应用常规诊断学方法常不能检出任何异常,但却是造成白血病复发的根源。这些残存在体内的微量白血病细胞,称为微小残留病(MRD)。对MRD的检测,有助于对治疗方案的评估、对患者疗效的监察和及早检出复发的可能性;另外在白血病患者作自身骨髓移植时,尚可用来定量检测骨髓中残存的白血病细胞。

在既往的研究中,对MRD的检测曾采用以下技术:(1)细胞形态学方法:定期作骨髓穿刺,进行细胞形态学检查。(2)细胞遗传学检查:进行骨髓细胞染色体核型分析或早期染色体凝缩检查。(3)细胞培养法:在体外进行骨髓细胞培养,观察克隆的形成数;亦有在实验动物体内进行培养的实验性研究。(4)免疫学检查:由于白血病细胞不存在特异性抗原,因此只能以单抗检测在正常祖细胞缺乏或极少表达的抗原,研究中常联合使用多种单抗进行检测。(5)Southern印迹分析:检查骨髓细胞基因组DNA,看有无初诊时存在的克隆性Ig基因和T细胞受体(TCR)基因的重排。(6)核磁共振成象(MRI):正常骨髓、白血病骨髓和肿瘤局灶浸润性骨髓在MRI上存在着差别,可用于诊断,但其在检测MRD方面的作用尚有待进一步研究。以上所述方法,不是特异性不强就是灵敏度不高,在检测的细胞群中若白血病细胞<10-3个则难以检出。(7)流式细胞仪检测:该仪器能自动、快速地分析混悬液中单个细胞的细胞周期、DNA含量及免疫表型,每秒钟可分析105个细胞。但由于缺乏白血病特异性单抗,不能以直接的或间接的免疫荧光法特异地标记白血病细胞,致使以流式细胞仪检测MRD受到限制。新近有报道,以双染色流式细胞仪技术进行检测,在某些情况下对恶性细胞的检出灵敏度可达10-4;即使如此,对检测MRD来说灵敏度仍嫌不足。

PCR技术具有极高的灵敏度和特异性,可用于MRD的检测。在理论上,样品中只要存在单个拷贝的靶DNA即可检出。但欲检出恶性细胞,在这些细胞中应具有正常细胞不存在的特异性分子标志。易位染色体提供了这样的标志。但由于存在以下问题,使易位染色体在恶性血液淋巴疾病中作为分子标志的作用受到限制:(1)在不同类型的恶性淋巴疾患中存在着不同的易位染色体,因此要检出恶性细胞,在检测前必须确知或高度拟诊为某一特殊类型的肿瘤,方好选用适合该易位相应的引物,否则不能有效地扩增靶DNA。(2)即使在特定类型的肿瘤,也不是所有病例都存在某一特定的易位染色体。(3)即使同一种易位,其断裂点在分子水平上,不同病例亦可各不相同,用同一对引物常无法扩增所有病例横跨断裂点的DNA。(4)虽然各种不同易位断裂点处DNA测序资料不断增加,但对许多重要易位的断裂点尚未进行分析,因此尚无法设计出能有效扩增这些易位靶DNA顺序的引物。

应用PCR检测恶性淋巴性疾患(包括ALL)的另一有效途径,是检测淋巴细胞Ig基因或TCR基因重排的构型。在造血干细胞向T细胞或B细胞分化的过程中,存在着TCR基因或Ig基因的重排。该重排在分子水平使相应基因的可变区(V)与多变区(D)、结合区(J)的不同片段连接。每一白血病性T系的或B系的细胞克隆,在V(D)J连接片段都含有独特的顺序。这不仅是由于在重排中使用了相应基因中V、(D)、J区不同的片段,也因连接的机动性造成非编码的N区(核苷酸随机插入和/或缺失区)。所以该部位的顺序对每一T和B系细胞克隆犹似独特的指纹,具有高度的特异性。T系的和B系的白血病通常为单克隆性,所以来自同一克隆的白血病细胞在1个或两个等位基因上具有相同的和独特的V(D)J连接顺序。

为了检出MRD,现研究使用的大多数方法需首先明了在白血病细胞中上述IgH或TCR基因内重排基因片段的连接顺序,方能合成互补性寡核苷酸充作引物或探针。因此,对每一病例来说,常需于初诊时应用Southern印迹分析得知患者的基因重排类型,方能应用适合的引物扩增出含有白血病细胞特异性的V(D)J连接顺序,继之应用直接测序法(不适于含有多个白血病克隆和含白血病细胞较少材料的测序)或应用测序载体克隆PCR产物后进行顺序分析,制备出该患者白血病细胞的克隆特异性探针,方能有效地用于该患者MRD的检测。

有人采用扩增IgH高度变异区——CDRⅢ(第3互补决定区)顺序的策略来检测B系ALL的MRD。采用的引物分别与特异连接顺序两侧VH和JH片段的保守顺序同源,在VH端与有义股一致,在JH端与反义股相同。应用CDRⅢ-PCR法检出B系急淋MRD的灵敏度达10-5,未发现假阳性。在Yamada应用的一对引物含有Sal I和Pst I的酶切位点,使PCR产物能与Bluescript载体重组进行克隆,因此也能定量检测残留白血病细胞在骨髓细胞中的百分率。该研究方法提示,欲治愈白血病,需达到白血病细胞在体内完全消失或在该法检出阈值以下的水平,其结果并显示,治疗期连续定量检测骨髓中的MRD可早期检出疾病的复发。

Nizet应用上述类似引物扩增IgH的VDJ连接区,无须测序,以Sau 96 I消化去除扩增产物中紧靠JH引物的顺序,用与VH引物3′端互补的6聚寡核苷酸作引物来标记制备克隆特异性探针。该方法检出MRD的灵敏度稍逊于上述测序法,检出限度为10-4~10-5

Yokota应用检测TCRδ基因重排的策略检测急淋的MRD。因为T-ALL基因重排主要为Vδ1DJδ1,而非T-ALL基因重排主要为Vδ23研究者根据文献中相应基因片段的碱基顺序对两种重排分别各设计出两对相套的引物,应用两次PCR技术制备出克隆特异性探针来检测T系的和B系急淋MRD,灵敏度达10-4~10-6。该法亦无需测序。

D′Auriol利用TCRr基因重排来检测MRD,两例有该基因重排的患者获得成功。新近Veelken等报道一种新颖的方法-PCR-RNA酶保护测定法,对有TCRr基因重排的急淋细胞系和患者的骨髓细胞DNA,应用Vr片断保守顺序引物和Jr片段保守顺序引物(附有T7RNA聚合酶的启动子)来扩增克隆性重排顺序。该PCR产物被转录成放射性标记的RNA探针。缓解期患者骨髓细胞的基因组DNA,用类似方法由DNA的对应股转录出试验性RNA。试验性RNA与探针RNA杂交,在杂交中不相合的核苷酸顺序被RNA酶A所消化,若能检出完整被保护的探针,则说明标本中存在白血病细胞。该法在细胞系DNA的稀释试验和患者的实际检测中,显示灵敏度达10-5。应用该方法,即使同一患者初诊时有多个白血病克隆或标本中含白血病细胞较少,亦不影响RNA探针的制备。在理论上,该策略可用于大多数抗原受体基因。该法不像上述类似方法,既不需测序,又不需合成白血病细胞特异性探针或引物。

在PCR检测MRD的研究中.出现的一个新问题是在疾病过程中有约18%的患者发生克隆演变,出现不同于初诊时新的白血病细胞克隆,因而给这部分患者应用PCR技术检出MRD带来了难题。

淋巴细胞分化过程中,IgH基因重排仅见于B系急淋,TCRr和δ基因重排虽见于绝大多数T-ALL和大部分的前BALL,但重排所用的V(D)J片段则不同(虽存在倾向性),因此现有的每一种方法只能适用于具有相应基因重排的患者,而缺乏普遍的适用性。发展一个普遍适用的技术,是今后研究的热点。策略之一是设计出多对针对不同受体基因重排的引物,在同一体系中进行PCR反应,总能扩增出某一存在的特异性连接顺序,可再以PCR-RNase保护测定法检出MRD。

【参考文献】:

1 D Aurrio1 L,et al.Leukemia,1989,3:155~158

2 Yamada M,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:5123~5127

3 Hansen-Hagge TE,et al.Blood,1989,74:1762~1767

4 Campana D,et al.Blood,1990,76:163~171

5 Yamada M,et al.N Engl J Med.,1990,323:448~455

6 Yokota S,et al.Blood,1991,77:331~339

7 Nizet Y,et al.Br J Haematol,1991,79:205~210

8 Veelken H,et al.Blood,1991,78:1318~1326

(同济医科大学刘树茂教授撰;费洪宝审)

随便看

 

科学参考收录了7804条科技类词条,基本涵盖了常见科技类参考文献及英语词汇的翻译,是科学学习和研究的有利工具。

 

Copyright © 2000-2023 Sciref.net All Rights Reserved
京ICP备2021023879号 更新时间:2024/12/23 6:02:02