“马铃薯抗病毒基因工程”的概念、定义、翻译、参考文献-科学参考

单词

马铃薯抗病毒基因工程

释义

【马铃薯抗病毒基因工程】

马铃薯是全世界重要的粮食作物之一。中国也是大面积栽培马铃薯的国家，目前栽培面积已超过4000万亩，居世界第二位，有的地区栽培面积占粮食作物总面积的10%以上，占当地粮食总产量的20%以上，特别是在北方，马铃薯不仅是重要的粮食作物，而且是冬季重要的蔬菜作物之一。但是，现有的马铃薯都存在抗病性差的缺陷。由于马铃薯的栽培种都是四倍体(2n=4x=48)，有的很难开花或育性降低或花粉不育，所以难以利用传统的育种手段进行改良。

马铃薯病毒病流行于世界各地。造成危害的主要病毒有马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)。PVX为害产生花叶，造成减产15%左右，可与PVY复合侵染，致使块茎畸形、瘦小、开裂，产量逐年下降，品质变劣，一般造成减产30%～40%，严重时可达80%～90%，甚至绝收。PLRV使马铃薯叶片卷曲、皱缩，减产50%左右。据统计，全世界每年仅因PLRV为害，就损失马铃薯2×10⁶t。目前，我国绝大部分地区由于病毒严重为害，马铃薯普遍退化，无法就地留种，每年都必须从高纬度、高海拔的地区调种，造成运输困难和成本提高。虽然可以通过茎尖拨离的方法脱毒，但种植几代后又因病毒感染而退化，不能从根本上解决问题。近年来，植物基因工程和病毒分子生物学的发展为抗病毒基因工程开辟了一条新途径。

早在1929年，Mckinney就发现了植物相关病毒之间存在交叉保护现象，即感染了病毒某株系的植物可以抵抗相关病毒株系的侵染。随着研究的深入，已经确证这种交叉保护作用与病毒外壳蛋白有关。因此，R．Beachy等(1986)首次分离了烟草花叶病毒(TMV)U1株系的外壳蛋白基因，并在5′端加上强启动子——花椰菜花叶病毒的35S启动子，在3′端加上胭脂碱合酶基因的Poly(A)加尾信号，通过根癌农杆菌的Ti质粒转化系统，用叶盘法将这一嵌合基因整合到烟草细胞的染色体上，转基因烟草工程植株可以高水平地表达外壳蛋白基因(占细胞可溶性蛋白的0．05%～0．1%)。当接种U1株系TMV病毒时，植株表现明显的抗性，病症的出现被延迟。转基因植物具有以下几个特点：抗性与基因整合的拷贝数和基因表达水平呈正相关；不抗病毒RNA攻击；能稳定遗传。Beechy等人的研究结果为进一步开展植物抗病毒基因工程奠定了坚实的基础。

C．Hemenwey(1988)将PVX CP基因正向和反向插入35S启动子和豌豆小亚基E93′端之间，转化烟草，经Western检测CP基因表达占总蛋白的0．02%～0．1%，遗传分离规律为3：1(CP+∶CP－)。当接种0．5μg／mlPVX粒子18d后，所有对照植物均感病，发生系统侵染的工程植株不到10%；当攻毒浓度提高到5μg／ml时，仅有13%的工程植株发生系统侵染。接种PVXRNA时，CP表达高的植物仍有较高的抗性，这与Beachy等人的报道不符。表达反义CP基因的工程植株只有在攻毒浓度较低时才有抗性。A．Hoekema等(1989)将荷兰株系的PVX CP基因转化到极易感病的商业马铃薯品种Bintje和Escort中，有5个转基因株系CP基因表达量高于可溶性蛋白的0．1%，接种10μg／m1 PVX时，工程植株能延迟系统病症的发生和显著地降低病毒的累积。细胞学分析有97%的工程植株表现正常。因此，可以通过基因工程的方法向植物引入新的外源性状而不改变其固有的特性。

C．Lawson(1990)将PVX CP基因和PVY CP基因分别插入35S启动子和7S、rbc小亚基E9之间，然后构建一个同时含有两种CP基因的表达载体，PVX CP和PVY CP基因在马铃薯工程植株中的表达水平分别为0．05%～0．2%和0．01%～0．05%，当分别接种5μg／mlPVX和20μg／mlPVY36d后，用ELISA检测，没有检测到PVX，而对照的值为69；PVY感病率小于20%，而对照则80%以上感病。当用5μg／ml PVX和20μg／ml PVY混合接种36d后，80%的对照感染PVX和PVY，工程植株只有3%～30%感染PVX和27%～70%感染PVY。用蚜虫传播接种36d后未发现PVY侵染。

van der Wilk F(1991)将PLRV编码的CP基因整合到马铃薯品种Desiree中，转化的工程植株在35S启动子作用下表达了CP RNA序列，但未能检测到外壳蛋白的积累。接种PLRV时，工程植株能降低病毒繁殖率。

近年来国内也开展了上述领域的研究。吕玉平等人(1991)利用λ-ZAP Ⅱ构建了PVX_cDNA文库，用特异性的探针筛选，获得了全长的CP基因，DNA序列分析的结果表明它与前苏联、荷兰、阿根廷株系的同源性分别为97．3%、97．0%、79．7%。已将该基因重组到含有双35S启动子和TMV ω表达增效子的双元载体pBIN438中。利用根癌农杆菌LBA4404转化我国主要栽培品种克新4号、Farivote，经多聚酶链式反应(PCR)检测转化植株，获得了抗PVX的马铃薯工程植株。王春香等(1991)也报道了PVX CP基因的克隆。周雪荣等人(1991)构建了PVY cDNA文库，克隆了CP基因，其DNA序列与PVYⁿ和PVY°株系的同源性分别为95．5%和93．6%。已将PVY CP基因重组到pBI121质粒中。诸端银等人(1992)从感染PVY的烟草叶片中直接提取RNA，利用特异性的引物进行cDNA的合成和PCR扩增，也得到了PVY CP基因。张鹤龄(1992)克隆了PLRV CP基因。这些研究目前多处于转化马铃薯阶段，尚未见到抗性工程植株的报道。

所有转CP基因的研究资料表明，工程植株在一定程度上都有抗病毒的特性，并且能够稳定地遗传，遗传规律简单(CP+∶CP=3∶1)，工程植株容易通过常规自交选育而获得纯合子，从而加速育种进程。但是，利用病毒外壳蛋白基因使植物获得抗病毒能力仍有其局限性，工程植株的抗性水平不高，且抗性受CP基因整合的拷贝数和表达水平影响。因此，如何调控和提高CP基因的表达水平已成为当今的研究热点，如利用双35S启动子和一些表达增强子提高CP基因的表达(吕玉平1991)；利用高等植物偏爱密码子进行CP基因的定点突变，使其更适合于受体植物的表达系统；利用特异性的启动子进行基因的定点和定向表达，如病毒侵染时植物产生特异蛋白的启动子，HRGP(伸长蛋白)启动子主要在韧皮部伴细胞转录，这对PLRV CP的定向表达和抗性是极其有用的，因PLRV在植物体内主要存在于韧皮部。

此外，对利用病毒复制酶基因组份、Ribozyme和特异性的抗体中和病毒复制所需的关键酶等也进行了较深入的研究。D．Golemboski等(1990)报道了令人惊异的发现，将TMV复制酶组份54KDα蛋白编码的序列导入烟草中，工程植株与转CP基因的工程植株相比具有显著的不同：其抗性水平与整合到受体植物染色体上的基因拷贝数无关，能抵抗病毒裸露RNA的攻击；抗病水平高，一般表达CP的工程植株只是使植物延迟发病，当受到浓度大于50μg／ml病毒侵染时，保护作用就被克服了，而转TMV 54KDα基因的工程植株可抗高达500μg／ml TMV粒子和300μg／ml TMV-RNA的攻击，工程植株在整个生长过程中都不发病。推测TWV 54KDa基因使工程植株产生抗性的机理是其有一个为病毒复制所必需的Gly-Asp-Asp框架，当包括该框架在内的54KDα基因在工程植株中进行组成型转录和翻译时，干扰了病毒的复制。由于PVY NIb基因中也有Gly-AspAsp框架，吕玉平等人(1992)利用PCR技术克隆了PVY NIb基因，并进行了DNA序列分析，构建表达载体，以期转化马铃薯，获得高抗PVY的工程植株。

Ribozyme是从某些病毒的卫星RNA或类病毒发现的，它能够特异性地识别RNA的5′GUC3′位点的一类小分子RNA，只要在5′GUC3′和5′和3′端有6～8个碱基与靶RNA配对并有一个特殊的锤状结构，即可在靶RNA在GUC位点剪切。Hay(1990)在PLRV编码的CP和聚合酶基因RNA中设计了两个Ribozyme，在T7 RNA聚合酶作用下进行体外转录和剪切实验，在40℃条件下有剪切活性，而在0℃时则无剪切活性。因此有待于进一步研究，使其能在自然的条件下具有剪切活性，方可进行工程植株剪切外侵病毒RNA的研究。

植物抗病毒基因工程的研究，在短短的几年内已取得到可喜的进展，预计在今后的10年内将着重进行抗病毒基因的表达调控、病毒复制酶组分、Ribozyme和抗体中和酶等多途径的探索以用集中多抗性于某个优良品种的研究，为进一步开展马铃薯抗病毒基因工程开辟新的途径。

【参考文献】：

1 Powell P A，Beach R，et al．Science，1986，0232：738～743

2 Hemenway C，et al．Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein or its antisense RNA．EMBO J，1988，7：1273～1280

3 Hoekma A，et al．Bio／technology，1989，7：273～278

4 Lawson C，et al．Bio／technology，1990，8：127～134

5 Golemboski D，et al．Proc Natl Acad Sei．USA，1990，87：6311～6315

6 Hay R T，et al．Journal of General Virology，1990，71：2257～2264

7 Van der wilk F，et al．Plant Molevular biology，1991，17：431～439

8 吕玉平，等．北京农业大学学报，1991，17(4)：117～120

9 周雪荣，等．中国科学B辑，1991，11：1173～11179

10 Lu Y P，et al．The Abstracts of the third Asia Potato Association Cofenerce，1991．95～97

(北京农业大学生物学院吕玉平博士撰)

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