【紫外光－可见光－近红外光分光光度法】
拼译：uvvis－nir－spectrophotometry
紫外－可见－近红外分光光度法是各种光谱方法的基础，经过长期使用和不断发展，已经成为很多基础理论研究和生产实践所不可缺少的基本手段。它是测定由于物质对紫外(190～340nm)，可见(340～750nm)，或近红外(750～2500nm)区波长的选择性吸收而产生的吸收光谱，并借助于吸收光谱对被测物质进行定性分析或定量分析。
1．定性分析的依据。当光进入一种物质后，可以有两种情况：一种是进入物质后能量几乎不被吸收；另一种是能量被全部或被部分吸收。后者在吸收光的过程中，光能被转移给分子，但是吸收本身是一种高度专一的现象，即一定结构的分子只吸收一定能量的辐射。分子吸收光能后就发生能量的改变。每个分子具有一系列严格分立的能级。处于基态的分子受到光能激发时，它可以吸收特征波长的能量跃迁到较高的能级(激发态)。特定波长的光被吸收，就产生吸收光谱。如果物质分子吸收的能量越多，跃迁到激发态的能级就越高，产生的吸收光谱的波长就越短。据此人们就可以根据吸收光谱的形状，特别是吸收峰的波长位置来对物质进行定性分析。但是紫外－可见－近红外区的吸收光谱常常不是线光谱，而是宽光谱。宽光谱中常包含复杂的谱带系，一个谱带系可能有若干个谱带，一个谱带又由若干谱线组成，情况复杂，难以根据吸收峰的位置来确定是某种物质，所以紫外－可见吸收光谱虽然可以用来作定性分析，但不是理想的定性分析工具。2．定量分析的依据。紫外－可见吸收光谱作为定量分析的基本依据是比尔定律。这是由布给(Buguer)、朗伯(Lambert)和比尔(Beer)分别于1729年和1852年提出的。他们根据一系列的实验资料证明当一束单色光透过介质时，吸收的比值(透射光／入射光)和入射光的强度无关，但和介质的厚度以及介质中分子的数目(即浓度)有关。把它写成公式就是：
式中A和T分别是吸光度和透光度，常用作纵坐标。a是吸光系数，是物质的特征常数。b是介质厚度。c是浓度。从公式中可以看出，吸光度是与介质的厚度和浓度成正比的。这就很容易在紫外－可见分光光度计上通过测定吸光度来进行定量。吸光系数有两种表示方法：如介质浓度为1mol／L，光径为10mm，则称为摩尔吸光系数，用
．λ表示，在生化分析中常用。如样品浓度c为1%，光径为10mm，则称为百分吸光系数，用
．λ表示，在分析化学中常用。透光度T因为与浓度c成指数关系，计算不便，所以在生化分析中不常用。紫外－可见－近红外分光光度计一般由光源、单色器、样品室、检测器、控制线路、结果显示器6部分组成，它们以直线结构排列。(1)光源：钨灯和碘钨灯常用作可见和近红外范围的光源，前者可使用的波长范围约为320～3200nm。后者约为340～1200nm。但可增大发光强度，并延长使用寿命。紫外范围的光源常用氢灯和氘灯，使用波长范围约为180～360nm，但后者在发射强度和灯的寿命方面都比前者要大2～3倍，且氢灯在300nm以后能量已很低，但氘灯可使用到500nm。(2)单色器：单色器的作用是将光源发出的白光色散成各种波长的单色光，从出射狭缝中导出照于样品上。分光光度计中的单色器是一个完整的色散系统，除了色散元件(棱镜或光栅)外，还有入射狭缝和出射狭缝以及一组反射镜。(3)样品室：样品室可以容纳各种光径的吸收池和附件，如恒温、低温、升温、积分球、薄层扫描等。测定用的吸收池一般分石英和玻璃两种。紫外区一定要用石英池，可见区和近红外区用玻璃的，也可用石英的。(4)检测器：光电池和光电管已被灵敏度大、光谱响应范围宽的光电倍增管代替。它实际上是配有两次发射电极的光电管，使得光电流得到几十万倍乃至几百万倍的放大。1980年后又发展了光电二极管矩阵检测器。(5)放大线路：单光束分光光度计通常采用光－电转换方法。双光束分光光度计多采用光学零平衡式光－电系统或电学比例记录式系统。(6)结果显示器：单光束分光光度计用数字显示并连接打印装置。双光束分光光度计除了用记录器外，还兼有数字显示和打印装置。结果显示发展为屏幕化后，光谱图、操作条件和数据均可在屏幕上显示，并且利用计算机还可以将数据进一步处理。各种类型的分光光度计按它们的波长范围可分为可见分光光度计(比色计)、紫外－可见分光光度计和紫外－可见－近红外分光光度计。按它们的光学系统则可分为单光束、双光束和双波长／双光束3种。(1)单光束分光光度计：单光束分光光度计只有一条光束，通过变换参比和样品的位置，使其分别进入光路，就可在结果显示器上读出样品的透光度或吸光度。没有引入计算机的单光束分光光度计不能扫描吸收光谱。有了计算机，可先储存参比信号，再扫描样品，并在每个波长将样品信号减去参比信号，就可得到样品的吸收光谱。用光电二极管矩阵作检测器的单光束紫外分光光度计，具有快速扫描的独特优点，给追踪化学反应过程提供了极为方便的手段。(2)双光束分光光度计：既可直接读数，又可扫描吸收光谱，还可以增添很多附件，扩大使用范围。(3)双波长／双光束分光光度计：主要用于测定混浊样品。由混浊样品的溶质颗粒造成的散射光使表观吸光度增加，甚至光谱产生畸形。美国Chance实验室在1951年巧妙地利用样品在峰位和峰谷的吸光度之差来准确地测定样品的真实吸光度，设计了世界上第一台双波长分光光度计。双波长分光光度计常常同时可作双光束测定。紫外－可见分光光度法以使用方便、准确、迅速、用样量少等优点而被广泛地应用在各个领域，包括农、林、牧、副、渔、医药、环保、地矿、冶金、物理、化工、钢铁等并成为这些领域的实验室必备的手段。它可用于：(1)未知物质的鉴定：将未知物质的吸收光谱与标准物质的吸收光谱相比较，如果吸收光谱的形状完全一致，就可初步认为是同一种化合物。但含有相同发色团的不同物质，常有相同的吸收光谱，所以还必须通过改变实验条件后再测谱比较，甚至辅以别的方法才能进行鉴定。(2)分子结构的推测：如在220～250nm有强吸收表明化合物中可能含有C=CC=C结构单元。在260～300nm有中等强度的吸收则表示可能有苯环存在。(3)定量分析：紫外－可见分光光度法是定量分析最有效的手段。根据朗伯－比尔定律，吸光度与浓度成正比的关系可以先配一套已知浓度的溶液，测出吸光度，画出标准曲线。再测未知溶液的吸光度，就能从标准曲线上查得未知物的浓度。采用仪器上“浓度直读”的功能定量测定就更为方便。(4)杂质的测定：将混合物的光谱进行多组分分析，便可检测杂质的含量。但如采用双波长法或导数光谱法则更方便、准确和灵敏。(5)研究反应动力学：在固定波长下连续记录反应物的或生成物的吸光度随时间的变化曲线，可用于各种动力学研究。(6)反射测量：如果对固体样品进行色度分析，可用积分球进行测量。(7)差示光度法和差光谱法：如果样品浓度太大，可用差示光度法。如果欲知生物大分子的生色团的环境可用差光谱法。【参考文献】：1 Richard Alan．Mortom Biochemical Spectroscopy．12，Adam Hilger，London，19752 洪呤霞，范世福，祝绍箕．分光光度计．北京：机械工业出版社，19823 陈国珍．分光光度法．北京：原子能出版社，19844 郭尧君．分光光度技术及其在生物化学中的应用．北京：科学出版社，1987(中国科学院生物物理所郭尧君研究员撰)