请输入您要查询的字词:

 

单词 生物细胞冷冻蚀刻电镜技术
释义

【生物细胞冷冻蚀刻电镜技术】
 

冷冻蚀刻电镜技术,又称冷冻复型电镜技术,是一种生物细胞电镜样品制备技术方法。利用这种方法所制取的复型膜,可以充分显示细胞膜、核膜和备种细胞器膜表面微细结构的变化,其分辨率可以以达到2nm。优于透射电镜超薄切片法的分辨率(2.5nm)。因此,该技术已成为近代研究细胞生物膜结构、开展分子生物学研究的重要形态学手段之一。

自从1950年以来,在国外先后有瞿尔(C.E.Hall)、梅里曼(H.T.Meryman)提出了有关冷冻蚀刻的雏形;到60年代穆尔(H.Moor)、布兰顿(D.Branton)等,使该技术得到改进并进入比较成熟阶段,1970年以后,又经过斯蒂尔(R.L.Steere)、西占贡赤堀宏等的不断改进,使该技术更加成熟,并很快发展起来,在国外文献中出现了大量以次序冻蚀刻法为研究手段的资料。

1978年河北医学院电镜实验中心,在国内最先采用冷冻蚀刻技术,并于当年9月在桂林召开的全国解剖学年会上发表了“冷冻蚀刻技术初步实验成果”的论文报告。1980年以后,国内又有几个单位引进了有关实验设备,并陆续发表了细胞学、组织学、肿瘤学,生殖生物学等医学生物学实验研究工作方面的学术论文,并有李文镇等编写出版了国内第1部冷冻蚀刻技术专著-《组织细胞冷冻复型电镜图谱》。冷冻蚀刻法的技术特点:(1)样品处理采用液氮冷冻,尽量消除理化因素的损伤,使细胞超微结构更近于生活状态;(2)通过样品切断-蚀刻,可充分显示不同层次的细胞膜微细结构及其膜表面镶嵌蛋白颗粒,为生物膜和分子生物学研究提供了实验手段;(3)采用投影喷涂制取铂-碳复型膜,使电镜图像具有浮雕样的鲜明立体感,可得到细胞超微结构的三维图象,有利于细胞重建工作的开展;(4)复型膜具有分辩力高,能耐受电子束轰击,可以长期保存等特点。

冷冻蚀刻法所需要的设备仪器,主要包括两类:一类是附件型,此型仪器的代表设备是日本日立HFZ-1型切断装置、FE1型冷冻蚀刻装置和HUS-5型真空喷镀仪,又称“铜块法”;另一类是专用型,此型仪器的代表设备是日本生产的EIKO.FD2A、FD-3A和西欧列支敦士登生产的Balzers-360型等冷冻蚀刻装置,此类设备的许多技术程序均为自动操作与控制。尽管仪器设备不同,其技术操作程序基本一致,都需经过:样品的预处理(戊=醛固定、甘油防冻处理),样品及切断装置的液氮冷冻,在一定真空度和温度下,将放入喷镀仪中的样品进行切断和加温蚀刻,对样品断面进行喷镀制取铂碳复型膜,把样品入腐蚀液中用铜网捞取复型膜,最后用透射电镜观察。

1980年以来,冷冻蚀刻法的技术及有关理论方面,国内外均有很大发展。在冷冻蚀刻技术方法上有了许多改进,并出现了以“快速冷冻复型法”为代表的技术方法,其主要技术特点是:在样品的预处理中,免去戊=醛固定和甘油防冻处理,改用快速冷冻装置,将新鲜样品放入其内与浸泡于液氮中的电镀金板快速接触冷冻,再将冷冻后的样品放入FD-2A冷冻蚀刻仪上,按常规技术程序操作,直至制出复型膜。利用上述方法所得到的复型膜,其细胞超微结构更接近于生活状态。该技术1979年由日本山田类智首创,在中国由李向印等于1981年建立这一技术方法1983年正式发表了学术论文。在冷冻蚀刻技术理论方面,1974年科勒(J.K.Kohler)等就冷冻蚀刻技术冰晶形成的理论方面,提出了自己的看法;菲希尔(K.A.Fischei)等通过实验研究,提出了克服冰晶形成的条件;松本明等,又在当年对蚀刻真空度、蚀刻与样品温度的关系,发表了学术论文。在中国李文镇(1982)、应国华(1990)等进行了有关实验研究,先后发表了冷冻复型技术经验介绍,冷冻蚀刻技术中的冰晶损伤,冷冻蚀刻技术中常见的人工损伤与假象等论文,从而使冷冻蚀刻法的操作成功率进一步提高,使其技术应用进一步趋向成熟。此外,根据生物样品的不同特点,特别是针对一些微小的生物样品(例如:细菌、游离细胞等),中国学者创建了特殊样品的冷冻蚀刻法,先后发表了游离细胞冷冻蚀刻技术,细菌的冷冻蚀刻技术及其图象的识别等论文,从而更加丰富和发展了冷冻蚀刻技术及其所观察的内容。

关于冷冻蚀刻法的技术应用,国内外学者亦开展了大量工作。在生物膜结构学说方面,1974年辛格(S.J.Singer)等,利用冷冻蚀刻技术在证明生物膜液态嵌模型学说方面,进行了广泛研究工作;1975年胡伯特(F.Humbert)等在复型膜所显示的镶嵌蛋白质微粒大小及其形态等问题上,发表了学术论文;1975年丹尼尔(B.Faniel)等,又在冷冻蚀刻劈裂面的命名方面提出了自己的看法,使现在对此问题有了比较统一的认识,即将膜的疏水后层面向胞质、核质、细胞器基质的面称为EF面,把面向细胞间隙、内间隙的面称为PF面。在器官与组织学方面,1974年伊藤(S.Ito)等,利用冷冻蚀刻技术对消化系统进行了详尽研究,提出了微绒毛EF面微粒少而平滑,PE面为凹面的看法;当年史劳德(P.claude)等,在研究肾小体的冷冻蚀刻图象中,发现球内系膜细胞突起附着于内皮细胞之外,其细胞间隙连接较多,故有调节肾小体面流量的作用;1976年砂田行(I.Sadayuki)等利用该技术所进行的呼吸系统研究中,证明Ⅰ型上皮、毛细血管内皮上都只有紧密连接,1983年马山斯基(V.F.Mashansky)等,对表皮及其他复层扁平上皮内的细胞连接进行了研究,认为桥粒是其主要连接装置。在细胞学研究方面,1975年斯维尔(N.J.Severs)等,对核膜所作的冷冻蚀刻电镜观察中,发现核膜的壁裂面可出现较其他膜结构更为复杂的情况,核孔可出现多种多样的图象;1978年郎格(R.D.A.Lang)利用该方法对线粒体进行了研究,认为线粒体在体外培养情况下,在培养基中加入不同离子右改变其通透性,从而使线粒体基质的体积得以改变。在中国,1979年雷建章等,总结了国外利用冷冻蚀刻技术开展的细胞超微结构研究工作,发表了《冷冻蚀刻技术在超微结构研究中的应用》论文;1981年应国华等利用该技术对胃癌和乳癌细胞进行了观察研究,发现胃癌细胞膜间隙连接减少,紧密连接走行曲折复杂;1981年王促涛等,对胎儿肾脏的冷冻复型观察中,证明了14周胎儿肾小管上皮细胞质膜平直无镶嵌连接,但有较为复杂的紧密连接;1982年汪德耀等,对北京鸭精子发生过程中膜结构的变化情况,作了冷冻复型电镜观察;宁爱兰等利用该技术,进行了维生素A对Eca109食管癌上皮细胞株作用的研究,1984年张朝佑等,利用冷冻蚀刻法作了犬心肌窦房结细胞膜结构的观察;1985年袁德霞等,又开展了针刺足三里对甲状腺影响的冷冻蚀刻电镜观察;1986年曾弥白等,观察到细胞紧密连按的形成,是由一个自侧膜向顶侧膜移动的极性化过程;1991年陈细法等,进行了纤毛细胞特化结构的冷冻蚀刻研究。

为了更好发挥冷冻蚀刻技术在生物膜研究中的作用,针对目前该技术存在的某些问题,近几年在仪器性能方面,进行了以下改进和提高:(1)努力提高仪器的真空度,由原来的1×10-5托,提高到1×10-7~1×10-9;(2)准确控制切断、蚀刻时样品的温度;(3)将盲目、随机切断,改为选择、定位切断;(4)尽量减少投影喷镀及复型膜的厚度。经过上述改进的专用型冷冻蚀刻装置制出的复型膜,具有反差适当、层次分明、分辩率高等特点,而且可使实验成功率大为提高。此外,为了观察生物结构在实验研究中动力学变化情况,急待开发冷冻蚀刻法与放射自显影、细胞化学、免疫电镜等相结合的技术方法,以得到膜内微粒,如:酶、蛋白、抗原和受体等的动态变化信息。

【参考文献】:

1 Bullivants.Advanced techniques in biological electron mieroscopy,1973∶67~107

2 Fircher K A,et al.Freeze-fraeture autoradiography.Feasibility.Jour Cell Biol,1979,70∶453

3 赤堀宏.冻结试料处理装置的开发.日本电子显微镜学会第35回学术讲演会演预稿集,1979,(35)∶174

4 李文镇,等.冷冻蚀刻技术初步实验成果.医学研究通讯,1979,1(1)∶32~34

5 应国华,等.冷冻复型电镜技术.中华物理医学杂志,1979,1(1)∶28~31

6 雷建章,等.冷冻复型技术在超微结构研究中的应用.中华物理医学杂志,1979,1(2)∶91~94

7 山田英智.生物试料的冻结技法.电子显微镜(日),1980,14(2)∶70

8 应国华,等.胃癌细胞のべ-之くぺか法ぃすち超微构造の观察.日本医床电子显微镜学会志,1980,13(3,4)∶255~260

9 李文镇,主编.组织细胞冷冻复型图谱.北京:人民卫生出版社,1981

10 李文镇,等.冷冻复型技术经验介绍和国外进展.电子显微学报,1982,1(2)∶16~19

(河北医学院电镜中心应国华撰;李文镇审)

随便看

 

科学参考收录了7804条科技类词条,基本涵盖了常见科技类参考文献及英语词汇的翻译,是科学学习和研究的有利工具。

 

Copyright © 2000-2023 Sciref.net All Rights Reserved
京ICP备2021023879号 更新时间:2024/12/23 10:58:19