| 单词 | 棉花体细胞胚发生和植株再生 |
| 释义 | 【棉花体细胞胚发生和植株再生】 棉花细胞和组织培养研究的历史，大体可以分为3个阶段：(1)愈伤组织的诱导和培养(1971～1978)；(2)体细胞胚发生(1979～1993)；(3)棉株再生(1983年至今)。 70年代初，大量的工作集中在对棉花愈伤组织的诱导和培养上。1971年，Beasley首次报道从陆地棉胚珠的珠孔端诱导形成愈伤组织，以后人们相继从棉属不同种的中胚轴、下胚轴、子叶、叶片、幼胚和茎等器官为外植体诱导出愈伤组织，并进行了多次继代培养。70年代末，Price和Smith首次报道从克劳茨棉细胞悬浮培养中获得胚状体，这一研究为获得再生棉花植株奠定了基础。Finer(1983)利用克劳茨棉进一步研究，从茎、叶柄和叶等器官的培养中得到了大量的体细胞胚，但没能得到再生植株。不久，Davidonis诱导陆地棉子叶的愈伤组织得到再生植株。这是棉株再生的首次报道，但周期长，重复试验不易成功。1986年，Shoemaker正式报道从陆地棉珂字213和201中得到再生植株。目前，已能从陆地棉许多品种(系)中获得大量再生植株，再生的体系已经建立。植珠再生的途径 植株再生的途径有两条：一条是器官发生；另一条是胚胎发生。谭晓连等曾用拟似棉的叶、叶柄和茎为外植体，在MS基本培养基上诱导形成了愈伤组织。将愈伤组织转移到分化培养基上，其中以茎为外植体形成的愈伤组织能诱导产生芽和根，继而形成完整的小植株。但形成的小植株数量有限，且苗弱，不能发育到开花结果。培养的基本程序如下：(1)愈伤组织的诱导：取无菌棉苗下胚轴0．5～1cm的切段，接种到改良的MS培养基上。培养1周后，切口处形成愈伤组织，1个月后，愈伤组织生长迅速。(2)体细胞悬浮培养：取培养约6周带有胚状体的愈伤组织，接种到改良的MS液体培养基中，进行悬浮培养。(3)胚状体的进一步发育：上述带有胚状体的愈伤组织经悬浮培养1个月后，可得到许多球形的、心形的甚至子叶胚及大量浅黄色的、比重较大的胚性细胞团；移出接种到不加激素的MS固体培养基上，经1个月左右形成许多子叶胚，转移到SH培养基上培养；1周左右可长出新根，同时胚轴不断伸长；1个月后可获得具有5～6片真叶、7～8高的幼苗，这时将幼苗移到盆中均能成活。通过体细胞胚发生途径也可不经过悬浮培养而直接将形成的愈伤组织转移到诱导分化的固体培养基上进行培养，产生胚状体。但胚状体的数量有限，萌发和成活都较困难，整个培养周期也长。上述几种棉株再生途径中，以经过悬浮培养的胚胎发生途径最为有效，因为器官发生途径需经过多次转移继代培养，诱导生根，才能形成小植株，其周期长。而胚状体是具有两极性的结构，可以直接再生植株，其周期短，且产生的再生植株多。目前已建立了陆地棉品种珂字312再生植株的实验系统，但不孕株率高。体细胞胚发生和植株再生的条件 (1)培养基和生长调节剂：已知下述3种条件下均能诱导植物体细胞胚发生，即不加任何生长调节剂；只需要加生长素；需同时加入生长素和细胞分裂素。Price和Smith发现，在诱导棉花愈伤组织形成胚状体时，在悬浮培养中加入2，4－D能促进悬浮物的生长，然后可形成许多胚状体。但是，若悬浮培养基中不加入2，4－D，则细胞生长差，只能形成少量胚状体，但子叶展开情况较好。因此，2，4－D可能不是诱导体细胞胚发生的必需条件。陈志贤认为，棉花体细胞胚发生可以分为两个阶段，其一是从液泡化的薄壁细胞到带有胚胎发生决定性的浓厚细胞质的细胞；其二是原胚细胞经球形胚、心形胚等过程发育为子叶胚。这两个阶段所需要的外源激素不同，一定浓度范围的生长素与激动素配合使用可以有效地促进第1个阶段，除去2，4－D，对第2阶段有利。这表明，胚的发生需要2，4－D和KT的配合使用，胚的发育则只需要KT，但KT的浓度不能超过1mg／L，否则便产生抑制作用。谭晓连等认为，尽管诱导外植体产生愈伤组织时常用2，4－D，但培养野生棉时以IAA的效果为好，而且IAA和细胞分裂素一起使用的效果则更好。Trolinder等发现，棉花珂字312的愈伤组织诱导和体细胞胚发生需要0．1mg／L2，4－D和0．5mg／L KT。上述的差异可能与棉种和外植体的种类有关。Kohlenbach认为，为诱发胚状体，需先在加有生长素的条件下诱导胚性细胞团，然后移至无生长素的培养基上，胚才能进一步发育。根据现有的文献资料，陆地棉胚状体的发生与生长素的关系基本符合Kohlenbach的观点。诱导棉花形成愈伤组织所采用的基本培养基有SH，IS，MS和BT等。但诱导胚状体时所采用的培养基大都是固体的或液体的MS培养基。长期以来，植物组织培养中一直采用琼脂作为固体剂，近几年来，在棉花组织培养中开始采用gelrite。(2)氨源：Price曾指出，棉花体细胞胚发生的关键是在培养基里需加入谷酰胺。这可能由于棉胚发育和萌发中氨的变化途径是从谷酰胺经天门冬酰胺、精氨酸转变为储藏蛋白质，再经精氨酸转变为天门冬酰胺。发育中棉胚的游离氨基酸和酰胺库里含有的大量天门冬酰胺，是从谷酰胺产生的。加入谷酰胺并转化为天门冬酰胺，这就为胚发生创造了类似正常胚发生的环境。Davidonis和Trolinder发现，不加NH4NO3，但是增加KNO3和GA3两倍标准浓度更有利于体细胞胚发生，这与Reinert在胡萝卜中获得的结果相似。Trolinder还指出，氮化合物对于胚状体的发生和成熟都有重要的作用，增加KNO3的浓度能促进胚的发生，表明硝态氮具有诱导胚状体的效果。(3)温度和光强：Smith认为，高光强(8000～9000lx)和29±1℃的温度是诱导棉花下胚轴愈伤组织发生的最适环境。(4)外植体的来源：从愈伤组织的形成而言，棉花子叶、叶片、胚珠、叶柄和茎等器官都能诱导形成愈伤组织，但以下胚轴切段作为外植体的效果最佳，故大多数都采用下胚轴作为外植体。体细胞胚发生的细胞学和组织学研究 棉花下胚轴切段在MS和IS培养基上可产生两类愈伤组织，一类为白色的或深绿色的，由切口处内部的细胞形成。其中绿色组织生长十分缓慢，很快即褐化死亡，白色的可连续继代培养并保持原来的形态不变。另一类为淡绿色的，表面光亮，呈突起状，由表皮下数层细胞分裂而成，随着愈伤组织的生长，逐渐突破表皮，呈松散状。这类愈伤组织经过一次继代培养，第1周至第8周开始变褐。以后在褐色愈伤组织上又重新长出淡绿色疏松愈伤组织，然后逐渐变为灰色或淡黄色，呈米粒状，再经2周培养即形成肉眼可见的胚状体。刘桂云等对戴维逊氏棉叶片切块离体培养下的组织学观察表明，在愈伤组织内部或表面，首先有部分薄壁细胞被诱导形成具细胞核大、细胞质浓、染色深的分生组织细胞，它们经多次细胞分裂形成多细胞胚性细胞团和具有早期胚状体结构的球形胚。球形胚再经心形胚和鱼雷形胚发育为子叶胚。棉花胚状体的发生，即由原胚经球形胚、心形胚和鱼雷形胚发育为子叶胚的过程是有有序进行的。但是，外界条件，如2，4－D、细胞密度以及外植体类别等都可能加速或抑制此发育的进程。Bajaj从二倍体非洲棉的和亚洲棉的下胚轴、胚珠和花药愈伤组织细胞中观察到，染色体为二倍体的细胞仅占30%～40%，另外还有单倍体、三倍体、加倍的四倍体和六倍体的细胞。郭香墨等对陆地棉愈伤组织的细胞染色体变异进行了研究，发现愈伤组织细胞的染色体数目变异较大。其中四倍体占47．7%；二倍体占28%；三倍体12．1%；其他依次是单倍体8．4%，六倍体2%，五倍体和13条染色体以下的细胞各占1%。培养的细胞中染色体数的变异是由于愈伤组织诱导时染色质的核断裂所致，但不排除许多因素影响培养组织的染色体组成。综观棉花培养的研究现状，应该重点开展下列几方面的研究。(1)探讨不同遗传型棉花体细胞胚发生与植株再生的条件。(2)棉花体细胞胚胎学的研究：为了研究胚状体的发生机理，需要建立一个稳定的实验系统。朱澂认为，一个良好的实验系统应具备下列5个条件：稳定性、可重复性、具有可控制的分化程序、有形态上可供鉴定的指标、细胞培养高度同步化。其中细胞培养的同步化最为重要。(3)染色体遗传行为的研究。根据郭香墨的研究，陆地棉珂字312的愈伤组织能较多地保持四倍体的水平，同时发现二倍体细胞发生的频率也较高。因此，在再生植株中必然会出现许多二倍体植株，通过染色体加倍可获得纯系。(4)开展棉花人工种子的研究。胚状体是一个裸露的胚，用适当的方法在胚状体表面包上一层有机化合物作为保护胚状体并提供营养的“种皮”，创造一个和种子相似的结构，称为人工种子。人工种子的生长有两个关键：首先应建立获得大量同步胚的体系，而且由体细胞胚产生的植株在表现型上应相似于亲本。其次是制备合适的种皮。根据陈志贤和Trolinder的研究，利用物理方法基本上可以获得陆地棉珂字312的大量同步胚，而且这些胚产生的植株在表现型上与亲本完全相似。因此，只要制备出合适的种皮，且包在体细胞胚的表面，则有希望制成棉花人工种子。棉花体细胞胚发生和植株再生为棉花遗传改良提供了广阔的前景。但在体细胞培养再生棉株的过程中，尚有许多理论性的和技术性的问题需要通过人们的努力获得最终解决。【参考文献】：1 朱澂．遗传学报，1978，5(1)：792 刘桂云．中国棉花，1983，1：43 罗士韦．植物生理学通讯，1983，2：14 小仓久和．天津农业科学，1985，2：455 陈志贤，等．中国农业科学，1987，20(5)：66 陈志贤，等．山西农业科学，1987，4：127 谭晓连，钱迎倩．遗传学报，1988，15(2)：218 韩碧文，刘涉兰．植物生理学通讯，1988，1：99 郭仲琛，金碧毅．植物学通报，1988，5(1)：510 张大力，王喆之．植物学报，1989，31(2)：161(北京大学董合忠撰) |
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