| 单词 | 新化学发光免疫分析试剂 |
| 释义 | 【新化学发光免疫分析试剂】 拼译：new chemiluminescence immunoassay reagents 1977年赫尔门(M．Halmann)等将高特异性的抗体－抗原反应与高灵敏的化学发光反应相结合，建立了化学发光免疫分析(简称CLIA)，它是用化学发光物质或酶标记抗体(或抗原)，以化学发光反应作最后检测手段，因此，化学发光试剂的性能决定了化学发光免疫分析的灵敏度，选择性，精密度及被标记物的稳定性。 化学发光试剂种类繁多，但是，目前用于化学发光免疫分析的发光剂主要有环酰肼类、吖啶酯类、菲啶酯类、1、2二氧四环金刚烷类、芳基草酸酯类。环酰肼类试剂在化学发光免疫分析中最常用的是鲁米诺(Luminol)和异鲁诺(Isoluminol)衍生物。1928年阿贝切特(H．O．Albercht)首先合成了鲁米诺，它是最早用于化学发光免疫分析的发光剂之一。用酶或金属络合物标记抗体或抗原然后使其催化鲁米诺－过氧化氢的化学发光体系，已广泛应用于化学发光免疫分析。自从卡托(T．J．N．Carter)和怀特赫得(T．P．Whitehead)等人于1982年和1984年先后发现虫荧光素和合成的荧光素对辣根过氧化物酶－鲁米诺－过氧化氢化学发光体系有明显增强发光作用以来，国外学者又相继研究了噻唑、噁唑、咪唑、苯酚类衍生物作为酶催化鲁米诺化学发光体系的增强剂，其中，6－羟基苯并噻唑和对碘苯酚增强效果最好。增强剂的研究给鲁米诺这一最经典的发光剂用于化学发光免疫分析注入新的生命力，大大提高了灵敏度。鲁米诺很少用作发光标记试剂，因为它标记抗体或抗原后，对发光体产生空间位阻效应，发光效率降低10倍甚至淬灭。1978年斯可洛得(H．R．Schroeder)等合成了一系列不同碳链的氨基烷基取代的异鲁米诺衍生物，其中ABEI［N－(4Aminobutyl)-N-ethylisoluminol］，已被广泛应用于化学发光免疫分析，测定对象达几十种。ABEI分子中的标记功能团丁氨基与环酰肼母体相隔4个碳原子，使得ABEI标记抗体(或抗原)后，对发光体的空间位阻效应大大减小，保持了一定的发光强度，同时被标记的抗体(或抗原)基本保持固有的生物活性。1982年巴特罗(A．Patel)等将ABEI与硫光气反应制得ABEI的异硫氰基衍生物，用于标记抗体、抗原，被标记的RIgG十分稳定，在一20C贮存数月后，其免疫活性和发光强度几乎不变，(而用I125标记的RIgG只稳定5～6周)最低检测浓度为10－17～10－16mol。1984年格都(A．Gadow)将ABEI与N－羟基琥珀酰亚胺反应制得ABEI－H，使ABEI中的氨基活化，易于标记抗体抗原。1986年和1989年文献相继报导了苯并芘－1、2－二羧酸酰肼－4－丁酸N－羟基琥珀酰亚胺酯和菲环酰肼类化学发光标记试剂。这两种试剂具有较大的共轭体系，大大提高了发光强度，已用于标记抗原和蛋白质等免疫分析。各种环酰肼类试剂在化学发光反应中，都需要加入催化剂，这样背景高、干扰大，使得该类试剂应用于化学发光免疫分析的灵敏度受到限制，用环酰肼类试剂标记的抗体、抗原，其生物活性和发光量子产率都有所降低。然而，各种吖啶酯类衍生物不需加入任何催化剂，只要加入适当的碱和氧化剂就可激发化学发光反应。1935年伽略(K．Gleu)合成了光泽精(10，10′二甲基－9、9－双吖啶硝酸盐)并发现了其化学发光性质，为研究吖啶类化合物的化学发光性质、应用及机理做出了开创性的贡献。1983年威克斯(I．Weeks)等合成了用于标记蛋白质的第1个吖啶酯。1985年雷查德逊(A．P．Richardson)等合成了具有氨基标记功能团的吖啶酯，用于测定孕甾酮，方法的灵敏度和精密度与放射免疫分析相近。1987年哈特(R．C．Hart)等发现先前报导的简单的苯基吖啶酯在H+浓度小于10－4条件下缺乏较长期贮存的稳定性。1989年拉乌(S．J．Law)等合成了多取代苯基吖啶酯，利用空间位阻效应改进了简单苯基吖啶酯在较高温度和中性条件下易水解的缺点。，同年马克普拉(F、McCapra)等合成了一系列吖啶酯、吖啶巯酯、吖啶羰基磺酰胺，研究结果表明吖啶羰基磺酰胺是一种特别稳定的化学发光标记试剂。1991年赫曼德(P．W．Hammond)等研究了9－苯基羧酸酯－10－甲基吖啶鎓的9－位亲核加成反应防止吖啶酯水解的机理，提出用一个不参与环化反应的“保护加合物”与吖啶环的9－位进行亲核加成反应，形成一种“被保护”的吖啶酯，改变了吖啶环的电子结构，并增加了吖啶酯周围的空间位阻，使羰基更不易受到亲核进攻，由此便得到更加稳定不易水解的吖啶酯。这一研究为合成性能更加优良的吖啶酯发光标记试剂提供了宝贵的经验和理论。1989年威勒井(M．V．Welzijn)等设计并合成了一类新型的吖啶酯试剂，它与大多数文献报导的通常的吖啶酯试剂不同之处是将具有标记功能的基团键合在吖啶环的10－位氮原子上。吖啶酯类发光剂发光效率高、体系简单、背景小，易于标记蛋白质、激素、抗体、抗原，被标记物的发光量子产率和生物活性几乎不损失，检测限可达10－20mol，是很有发展前途的化学发光免疫分析试剂。1986年林·威恩(H．T．Lin Wayne)首先合成了一系列菲啶酯类化学发光标记试剂，成功地用于标记兔抗IgG，检测线性范围宽(0．8ng～100ng／ml)其性能与吖啶酯类试剂相似，但近年来菲啶酯类试剂在化学发光免疫分析中的应用还未得到进一步发展。1972年韦琳嘎(J．H．Wieringa)等最早合成了1、2二氧四环金刚烷。1985年傅默仁(J．C．Humenlen)等在这个基础上，改造了金刚烷的结构，在金刚烷环上引进了易与蛋白质偶联的N羟基琥珀酰亚胺活化酯功能团，为化学发光免疫分析提供了又一类新发光剂。1987年斯却帕(A．P．Schaap)等合成了一种萘乙酸酯取代的1、2－二氧四环衍生物，在室温下与蛋白质共存时能被酶催化引发化学发光，从此，1、2－二氧四环金刚烷衍生物成为化学发光酶联免疫分析的重要发光底物。1989年勃朗斯登(I．Bronstein)等合成了新的1、2－二氧四环金刚烷衍生物AMPPD，用AMPPD能够检测溶液中固定在膜支持物上10－20mol的碱性磷酸酶。1990年艾德沃赤(B．Edwards)等又合成了一系列新的萘基1、2－二氧四环金刚烷磷酸酯发光剂；最近，文献报导了第二代的1、2－二氧四环金刚烷类发光底物，它是金刚烷环上5位取代的衍生物，能防止这些分子的聚集作用，降低了由热裂解引起的试剂背景，改善了碱性磷酸酶测定的信噪比。由芳基草酸酯、过氧化氢、荧光体构成的过氧草酸酯化学发光体系的量子产率高达22%～75%。1980年柯拜西(S．Kobayashi)等首先将TCPO的化学发光反应与HPLC技术相结合，测定了丹酰氯标记的氨基酸。1985年宏达(K．Honda)等系统研究了9种不同取代基的苯基草酸酯和19种荧光化合物的化学发光反应性能和应用。1986年和1989年，艾麦(K．Imai)和耐克西马(K．Nakashima)先后合成了一系列烷氧基取代的苯基草酸酯，这些草酸酯更适合与HPLC技术相结合用于化学发光免疫分析。引进表面活性剂能改善芳基草酸酯在化学发光反应的水溶性。目前用于化学发光免疫分析的芳基草酸酯主要有TCPO、DNPO、TDPO、DOPO；与芳基草酸酯相配合用作标记试剂的荧光体主要有荧光素、荧光素胺、丹酰氯等。芳基草酸酯的化学发光反应也可与酶免疫分析相结合，用于这一技术中的荧光体主要有DPA和ANS等。纵观国内外文献，近10年来已研制了许多新的化学发光免疫分析试剂，但有待于进一步广泛应用，使其转化为商品用于临床免疫分析。广大医学、生物、化学工作者期待着有化学发光标记的抗体、抗原出售。目前，国外已有几种化学发光免疫分析试剂盒出售，但远远满足不了化学发光免疫分析的研究和临床应用；合成发光寿命长、量子效率高、选择性好、易于标记各种生物活性物质的新化学发光试剂和研制新的化学发光免疫分析试剂盒是化学发光免疫分析发展的一个主要方向。化学发光试剂结构与性能之间的内在关系也有待于进一步深入研究。【参考文献】：1 Schroeder H R. et al. Methods in Enzymol, 1978,58:427 ～ 4332 Gijsbert Z.et al. Proc Int Biolumin Chemilumin. Symp. 4th. 1986,443 ～ 4463 Clifford man C. Eur Pat Appl, 1989.313.9194 LawSJ, et al.J Biolumin Chemilumin. 1989.4(1) :88～985 Hammond P W. et al.J Biolumin Chemilumin, 1991,6(1): 35～436 MaedaM,etal. Biolumin Chemilumin, 1991:119 ～ 122(福州大学张帆教授、庄惠生讲师撰) |
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