| 单词 | 高等植物PEPCase的基因克隆、表达与转移 |
| 释义 | 【高等植物PEPCase的基因克隆、表达与转移】 拼译：clone，expression and transfotmation of phosphoenolpyruvate carboxylase gene in higher plants 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase，EC．4．1．1．31)是C4植物光合CO2固定的关键酶，具有从光合CO2固定到氮同化的各种功能。它不仅存在于高等植物中，在细菌及蓝绿藻等低等植物中也存在。 1973年蒂因(I．P．Ting)等发现，在高等植物中，PEPCase主要以4种同工酶形式存在，即C4光合型同工酶、C3光合型同工酶、CAM型同工酶和非绿色型同工酶。由于PEPCase的结构与功能的多样性，近年来其基因结构与表达的研究受到极大的重视。20世纪80年代初以来，PEPCase的基因克隆、表达与转移研究已经取得较大进展。1984年S．Hisataka等对原核生物E．coli的PEPCase基因的克隆，和1985年K．Tsutomu等对倒囊藻中光合型PEPCase基因的克隆，为高等植物PEPCase的基因克隆奠定了基础。1985年，日本、美国的3家实验室几乎同时完成了玉米PEPCase的cDNA克隆。马克(H．H．Mark)等纯化其mRNA，体外翻译选择富含PEPCase mRNA的区带，作为模板反转录成cDNA，构建了cDNA文库，再鉴定出两个PEPCase cDNA克隆pPC1和pPC2。I．Katsura等则以表达型质粒pSI4001为载体，筛选到一个克隆pM52；pM52克隆虽然接近完整的PEPCase cDNA，但仍缺乏5′一端上游不翻译区序列。于是，Y．Shuichi等以改进的方法得到4个更为完整的克隆pM499、pM500、pM41、pM530。将诸多克隆的3′一端不翻译区相比较，发现Poly(dA)拖尾在PEPCase的基因家族中有多结合位点，其结合位点的不同是3′一端长度不均一性的原因。对pM500克隆5′一端序列分析发现，其中只有一个蛋氨酸密码，在一序列的附近也发现有CGCCATG(G)这一真核生物翻译起始的特征序列，再将推测的氨基酸序列与实际测定的序列相比较，便准确地确定了PEPCase的翻译起始点。自1981年开展PEPCase分子遗传研究工作以来，绝大部分研究者均以玉米为材料，近来人们又对CAM植物及其它C4植物进行研究。1988年，朱根(M．S．Jurgen)等以兼性植物冰叶松叶菊为材料，在盐胁迫诱导CAM碳同化类型的状态下，克隆了cDNA，从中筛选到4个克隆。1990年，克劳德(C．Claude)等又对高粱PEPCase cDNA克隆进行了较为深入的研究。在PEPCase cDNA克隆及基因结构初步分析的基础上，人们对其基因克隆进行研究。理查德(L．H．Richard)等以EMBL3为载体构建了玉米的基因文库，从中筛选到5个PEPCase基因克隆，但未对其进行亚克隆；将各克隆片段分别与不同来源(根、黄化叶及绿叶)的DNA及mRMA杂交，发现其中有3个可同时与根、黄化叶及绿叶中的DNA、mRNA杂交，而另一个只与绿叶中的mRNA杂交，这表明决定C4光合型PEPCase的基因是单拷贝的。K．Takao的研究资料也表明，决定根部PEPCase的基因也是单拷贝的。这些都表明高等植物的PEPCase基因是由一个小的基因家族构成。马克(H．H．Mark)等用cDNA探针进行的Sorthern杂交结果表明，PEPCase的基因家族约由6个成员组成，其中不同的重复序列决定不同的PEPCase同工酶，决定非绿色型的、C3型的等同工酶的PEPCase基因克隆尚未鉴定出来，家族中各成员的相互关系及其进化历程等尚无直接证据。但以不同克隆片段为探针的大量Southern杂交实验结果则暗示，C4型PEPCase基因是其它PEPCase基因通过基因重复进化而来(O．Bjorkman，1976)。1989年，理查德等克隆了PEPCase基因后，又对包含C4光合型PEPCase基因的H1λ14克隆进行了详细的结构分析。几乎同时，M．Makoto等也报道了玉米PEPCase全基因为6．781kb，外显子、内含子的数目及5′一端调节序列的分析也相同，而转录起始点除了在－84有一个外，认为在－81位也有一个起始点。约翰(C．C．John)等又以Mesembryanthemum crystauimun为材料克隆了CAM型PEPCase的基因，并进行了全序列分析。1989年，理查德进行Northern杂交发现，C4型PEPCase在幼叶、绿叶、内叶鞘、穗、幼茎、根外皮及种子中都有表达，只是在不同部位的表达程度不同而已，并非叶片专一，也不是Kranz环依赖型的。1986年，马克等和理查德等以不同PEPCase同工酶的cDNA克隆为探针的杂交实验结果则表明，不同类型的PEPCase同工酶在不同器官中表达有差别。研究资料表明，维管束鞘细胞的核基因中有PEPCase基因存在，但实际却不表达(通过免疫组织化学定位法已确认PEPCase存在于叶肉细胞而不存在于维管束鞘细胞)。1989年，N．Jarunya等对DNA甲基化的研究资料认为，维管束鞘细胞中DNA的甲基化导致基因结构上的差别，可能是PEPCase基因不能在维管鞘细胞表达的原因之一。PEPCase基因表达受光、盐逆境的调节已有较多研究，受氮代谢与温度的调节也有一些研究。总之，对PEPCase基因表达的研究尚不够全面与深入，尤其在表达机理方面还有待探讨。向C3植物导入具有高CO2亲和力的C4一型PEPCase的基因，以期在光合碳同化水平上提高C3植物的光合效率，是植物高光效遗传工程育种的重要方向之一。1988年，D．Tagu等将PEPCase的cDNA(来自高粱cDNA克隆pP26B、1．35kb)与NPT Ⅱ基因PCaMVNEO(具卡那霉素抗性)以共转化方式直接导入C3植物矮牵牛的原生质体中，并成功地分化出愈伤组织与植株，转化效率达50%～80%。对筛选出的抗卡那霉素的愈伤组织及再生植株，分别以NPT Ⅱ及PEPCase的cDNA为探针进行Southern杂交，结果表明两者均已整合到核基因中，但有的只与两者之一杂交，有的却同时与两个探针杂交，说明共转化中的基因整合是相互独立的。1991年，董龙英、凌俊等将具有全编码序列及3′－终止信号的2．0kb玉米PEPCase cDNA克隆到Binary vector PBin 19质粒中，通过农杆菌介导的Leaf-disk方法转入C3植物烟草中，研究其转化效率、瞬间表达及基因整合等，此项开创性工作仍在进行之中。80年代以来，PEPCase的基因克隆、表达与转移方面的研究已经取得较大的进展，但仍有一些关键问题尚待解决，如PEPCase基因家族的精细组成尚未了解，有些成员的基因克隆尚未得到，基因结构中光调节启动子及一些重复序列的功能尚无准确的实验数据，在基因序列与酶功能结构域间的关系、转基因方法的有效性以及获得稳定遗传的高光效转基因植物等方面，都有待深入研究。【参考文献】：1 Hisataka S,et al. Gene,1984,31:2792 Mark H H,et al. J Biol Chem. 1986,261(13) :61323 Richard L H,et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1986,83:28844 Tagu D,et al. Protoplasma. 1988,146:1015 Richard L H,et al. Plant Mol. Biol 1989,12:5796 Claude C,et al. Nucleic Acids Res. 1990,18(3) ～ 6587 董龙英，凌俊．植物生理学通讯，1991，27(6)：407～4128 凌俊，等．植物生理学报，1992，18(3)：225～232(安徽师范大学吴晓东副教授撰；孙昌璜审) |
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