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单词 高效液相色谱检测技术
释义

【高效液相色谱检测技术】
 

高效液相色谱法适用的范围很广,在医药学及生命科学中已成为一种主要的分离检测手段。近年来高效液相色谱检测技术从最常用的紫外可见分光光度检测器和差示折光检测器开始,已经发展了诸如能够实时定性和定量的二极管阵列紫外可见分光光度检测器。能够快速扫描和光谱分辨率更高的色散型紫外可见分光光度检测器以及适用于生物化学的电化学检测器等等。各种联用检测手段如与质谱联用的热喷雾和粒子束接口等已日趋成熟。与傅里叶变换红外光谱和拉曼光谱的联用技术亦在发展中。各种检测器的灵敏度、线性范围、稳定性和重现性等主要指标日益提高。许多新的检测手段已为科技工作者所熟悉和使用。目前比较引人注目和发展较快的为手性化合物的直接检测和通用型质量检测技术。

1.手性化合物旋光检测器 药物的疗效及其在体内代谢的机理对如何发挥药物的最大作用和减少副作用愈来愈引起重视。在研究中,人们发现了光学对映异构体对生理作用的重要性。

目前手性化合物的高效液相色谱分析方法通常有:

(1)用手性固定相分离,即将具旋光活性的手性基团键合至固定相上。利用极性相互作用、氢键键合、π-π键相互作用、手性空穴及结合在硅胶上蛋白质的疏水或极性相互作用等可对手性化合物进行选择性分离。

(2)在流动相中生成对映体,被分析物与手性对离子生成离子对,用普通条件进行分离。但此法要受到对离子的化学性质、纯度和在流动相中溶解度等条件的限制,特别是反应的平衡时间长,重现性也有限。

(3)通过衍生化生成对映体分离,即用柱前手性衍生化试剂生成衍生物用普通条件进行分离。例如,含羟基化合物可用1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯(FLEC)等衍生化、氨基酸等与邻苯二甲醛和N-乙酰基-L-半胱氨酸结合的试剂衍生化而进行分离。

上述方法的顺利与否取决于固定相、试剂和条件的选择,而且分析步骤是否严格重现和外来干扰能否有效排除等也有影响。

以偏振计(旋光计)作检测器,用普通分析手段检测手性化合物的想法始于70年代。1982年据此出现了相应的仪器,但由于使用的是气体放电光源的机械旋光计,灵敏度很低,且光源稳定性差,达不到要求,致使这种检测方法未被正式采用。

1989年Lloyd等用二极管激光器作光源,研制了二极管激光器高效液相色谱旋光检测器。与其他检测器结合使用可以在部分或无手性分辨条件下测定对映体的纯度。

旋光检测器对手性化合物检测的专属性好,激光光源的波长适用于各种化合物,无需与吸收带的波长相符合。由于激光束的直径及发散度很小,因此可以用小孔径长光程液相色谱池同时满足池容积小而灵敏度高的要求,可测旋光的灵敏度低达几个微弧度,定量的线性范围可达50μg~50mg/ml。根据理论,通过增加比旋度及减小色谱峰宽可以进一步改善检出限。

旋光检测器测得的旋光度对手性化合物分子有如下关系:

α=〔α〕CL (1)

式中,α=测得的(+)-对映体旋光度,〔α〕=手性化合物(+)对映体的比旋度,C=手性化合物(+)-对映体的浓度,L=液相色谱池光程长度。

旋光对映体混合物的旋光度与浓度关系如下:

(+)-对映体:α=〔α〕LCX (2)

式中X=(+)-对映体的克分子份数。

(一)-对映体:α=-〔α〕LC(1-X) (3)

混合物中(+)-对映体的旋光度为

α=〔α〕LC(2X-1) (4)

即仪器给出的旋光信号与对映体的相对比例有关,可由下图的校正曲线说明。

由于仪器给出的信号只代表该浓度时两种旋光对映体的比值,因此当两者比例趋近相等时,旋光读数即行减小,直到完全消旋时,旋光值等于零。因此该化合物的总浓度需要用常规的液相色谱检测器如紫外可见光吸收检测器或差示折光检测器等串联测定,同时给出旋光信号及常规检测器测定信号。旋光检测器及常规检测器的信号与浓度关系为:

α∞C(2X-1)及A∞C

因此 α/A∞2X-1 (5)

将标准品与未知样品的检测器响应加以比较可得出如下关系:

式中下标u代表未知样品,s代表标准样品。

从应用角度来说,其应用范围及寿命也有限。其他如衍生化反应有反应不完全导致分析结果不准确之虞。应用本文所述检测器则不受一切条件的限制,且完全不必改动原来的液相色谱系统,仅在所用检测器前或后再串接一个旋光检测器即可。使用双通道色谱数据处理机可同时得到两个检测器的结果。在可用高级语言编程的处理机上,可通过执行程序将结果直接计算出来。另一个优点是检测器没有可动部分,因而无机械磨损等故障发生。

旋光检测器逐渐引起人们的重视,目前已有多方面的应用:药物分析;食品分析;农药分析;其他。

2.蒸发型质量检测器。目前常用的通用检测器为差示折光检测器,但这种检测器对梯度洗脱及温度变化极为敏感,不适于很多色谱条件。再者,由于紫外吸收和差示折光检测器对某些化合物不敏感,有些溶剂和溶质的组合不适于用上述检测器。因此不能达到真正通用型检测器的要求。

蒸发型质量检测器结构简单,用光散射技术检测时样品结构不需具备紫外发色团和合适的折光率,并对梯度洗脱和流动相系统温度变化不敏感,由于属通用型,因此对被分析组分或杂质均有响应,可在一次分析中予以检出,对未知组分的鉴定更为有利。

质量检测器在通用性及对梯度洗脱不敏感等方面优于其他检测器,已在食品、油脂、高分子化合物及药物分析等领域中得到成功的应用。其通用性还表现在对各种物质均不几乎相同的响应因子。且质量检测器在分析前不需校正,便可将各种组分一次测出。在药物分析中,质量检测器十分适用于杂质检查、参考标准质量分析和作为降解机理研究的工具。质量检测器的应用有:药物分析;生化物质测定;其他。如用质量检测器的凝胶色谱法可以满足各种高聚物分子量的测定要求等。

总之,手性化合物旋光检测器和蒸发型质量检测器等液相色谱检测技术的发展给予高效液相色谱法以许多新的功能,扩大了高效液相色谱法在各方面的应用,对高效液相色谱法的本身的发展也有一定的促进作用。

(上海市药品检验所张叔良撰)

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