【分子进化】
比较地、定量地研究各类群生物间有关生物大分子的结构及顺序的异同，借以进行生物分类及亲缘关系的探讨，称为分子进化论或分子分类学。它是经典进化论与分子生物学相互交融形成的边缘学科。研究的对象是遗传信息分子——DNA、RNA，表信息分子——蛋白质、酶两大类分子。其发展经历了2个阶段：(1)60～70年代，蛋白质顺序分析和电泳技术的引入。发现特定蛋白质的氨基酸替换速度是基本恒定的。1962年Zuckerkanal和Pauling首先提出分子钟概念，日本学者木村资生于1986年提出了中立理论(Neutral theory)，或称“突变——随机漂变理论”。使生物进化步入定量研究的新时期。(2)80年代以后，DNA顺序分析，DNA再结合和限制性内切酶、多聚酶链式反应等技术的应用，对基因有了进一步的认识，发现了外显子、内含子，复制DNA、假基因、基因族、转座子等。发现核苷酸顺序的变化速度与其功能的重要性相关。提出了协调进化、水平基因转化等理论。
分子进化是通过基因突变，包括点突变和复碱基对突变实现的，前者包括替换、附加，缺失，后者有重复，插入和缺失，倒位和易位等方式。当前分子进化领域有以下几个主要方面。1．核内DNA量的测定。一般用单套基因组的DNA含量表示，又称之为C值。常用Feulgen染色细胞光度测定法进行测定。C值有2种表示法：(1)绝对法：以沙克(pg=10－12g)为单位，如人类和真兽类为3．5pg；(2)以某种生物的DNA量为标准，与其比较，按百分数对被测定生物进行标定。在整个生物进化中，从低等至高等，总趋势是DNA量的逐渐增加，如酵母菌为0．005pg，人类为它的700倍。但生物的机体水平与DNA量之间非完全平行，某些有尾类、肺鱼分别是真兽类DNA量的27和35～40倍。因此，C值除了进化意义外，还有某些适应意义。核DNA有二种性质的DNA顺序组成，一种称为简单顺序，它是结构基因的组成成分：另一种是重复顺序，是调节基因的组分。这2种组分有不同演化速度，在进化中并不是同步按比例变化的。所以，近来不少研究对其分别测定。2．分子杂交。1960年Doty等首先发明分子杂交技术。常用的方法有2种：(1)DNA热稳定性测定：即比较同源双链和异源双链之间解链热稳定性差异，解离温度是与DNA双链的同源程度相关的。所谓热稳定性就是50%的DNA双链被解离的临界温度，通常用△TS表示，它大致与被替换固定的碱基对百分数相等，与杂交DNA双链的非互补核苷酸成比例。对于简单顺序而言1△TS≈1%核苷酸差异，与进化时间对应，是1△TS=2－3Ma(百万年)。(2)放射性同位标定法：一般采用C14、P32、H3进行标记。把2个不同来源(物种)的DNA分子加热，使其解开为单链，用琼胶固定，其中一个单链作同位素标记。把这些单链放入加热到60C的琼胶中，使其按互补原则进行结合，放射性残留程度就是2种DNA分子结合的数量指标。3．内切酶片段长度多态分析。简称RFLP测定。此法利用能识别特定碱基对序列的限制性核酸内切酶对有关DNA分子进行单酶解、双酶解或不完全酶解，形成不同的片段长度，以统计其酶切位点的差异计算DNA碱基替换率。目前主要研究对象是Mt DNA(线粒体DNA)，它具有分子结构简单、分子量小、母系遗传、无组织特异性，提取方法简单、进化速度快等优点。其碱基突变率约为2%／Ma，适合于研究分异时间在一千万年以内的类群，即适用于种间和种内分化及亲缘关系的探讨。另一个研究对象是rDNA(核糖体DNA，)是一种中等重复顺序，内含高度保守的编码区和进化速度相对较快的间隔区，后者的进化速度与核外Mt DNA相比，是较慢的。因此，适合于研究分异时间在五千万年内的高级阶元。根据内切酶物理图谱，按Nei和Li(1979)公式进行类群间限制性位点共享度(
)的计算。
Nx和NY分别表示X和Y类群的限制性内切酶酶切位点数。
之后，再计算两者间的遗传距离：
4．聚合酶链式反应。简称PCR技术，是美国一公司于1985年发明的体外DNA扩增技术，方法简便快速。多采用耐高温的Tag DNA聚合酶。广泛用于遗传病早期诊断、胎儿性别鉴定、司法鉴定、癌细胞检测以及分子生物学的研究。在分子进化研究中也初露头角。例如对于古代冻死和馆藏标本中的DNA研究，甚至对于在一定埋藏条件下的化石DNA研究，而形成了分子古生物学一门新交叉学科。1990年在美国爱达荷州的中新世纪地层中发现的木兰化石叶绿体DNA，是迄今所知最古老(17～20Ma)和最长(820bp)的基因密码。5．蛋白质氨基酸顺序的排列和替换。查明同源蛋白的氨基酸顺序、替换、附加和丢失，以探讨类群间的亲缘关系和异同程度。细胞色素C是最早被测定氨基酸顺序，用于大进化研究的蛋白质。随着顺序测定仪器改进，被测定的蛋白质会日益增加。每种蛋白有一定的演化速度，这样就可以进行类群间分异时间的标定。但是，不同的蛋白质有不同的演化速度，它可以用单位演化时间(EUP)表示，它约等于1%顺序相异的平均时间(Ma)。凡有较重要生理机能的，其演化速度低，适于研究高级阶元的演化，如细胞色素C(15Ma)、H3、H4(330、400Ma)；而生理功能不太重要的，则有较快的速度，适合于低级阶元的比较，如免疫球蛋白和蛇毒蛋白，分别为1．7和0．8Ma。同样，亦可进行各种DNA的核苷酸顺序的测定和比较。6．蛋白电泳。蛋白质一级结构的改变，能产生电荷变化，在电场作用下，不同蛋白呈现不同的迁移率，可用电泳法进行测定。常用的有纸上电泳、醋酸薄膜电泳，淀粉电泳、琼胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。用电泳法测定特定的蛋白的电泳相似率和基因频率，然后算出遗传相似性和遗传距离。一般用Nei′s公式：
(Ⅰ示遗传相似性，XiYi分别示XY居群i位点的基因频率)，而遗传距离是D=－logeI。根据对于两栖类和鱼类的白蛋白电泳研究，1Nei′s D=18～19Ma。电泳法较适合于研究属种阶元分化。7．酶的研究。酶也是蛋白质，同功酶是主要研究对象，它可作为遗传标记，亦能定量地探讨亲缘关系。目前用于研究已有几十种同功酶。用电泳法来研究酶，测定基因频率，用遗传距离表示类群间的差异，一般用Roger′s公式计算遗传距离
(Xi、Yi分别为X、Y居群i等位基因频率)。遗传相似性S=1－D。在总结已有资料的基础上，不同等级的类元遗传距离有一个大致的数量估计，如属间为0．71～2．8，种间0．18～2．54，虽然总的趋热是随着亲缘关系的疏远，遗传距离渐次加大，但相邻类元间并无截然界限。8．免疫学研究方法。各类蛋白大分子都有免疫反应，抗原间的相互关系可用于分析类群间的异同程度和亲缘关系。免疫学方法很多，但目前用于进化研究的方法，常用微量补体固定法(MCF)。此法快速灵敏。可用单一纯抗原，也可用复合抗原，前者如白蛋白、运铁蛋白、Hb和溶菌酶等；后者如血浆蛋白。白蛋白是最常用的抗原。以交叉试验测定类群间的免疫距离(ⅠD)，表示相互关系。白蛋白免疫距离ⅡD=0．6Ma，而复合(白蛋白+远铁蛋白)抗原，1ⅠD=0．2～0．3Ma。在Nei′s电泳距离和免疫距离之间可作经验公式换算，如电泳距离与白蛋白免疫距离之间是：1D=35Ⅰ D，不同演化速度的蛋白质有不同的经验换算关系。分子进化研究，在近期除了大量的蛋白质(酶)电泳和免疫学工作，采用RFLP和PCR技术对古今生物的MtDNA、rDNA、叶绿体DNA等大分子的研究，将是研究热点。随着分子生物学和进化论的发展，使得分子进化研究在定量地探讨生物亲缘关系和系统发育方面更准确更完善。这有赖于蛋白质氨基酸和核酸核苷酸碱基对顺序测定的自动化程度的提高、大量生物大分子顺序的直接测定；各类生物大分子突变率和进化速度的标定和资料数字数学处理方法的不断完善。【参考文献】：1 Dobzhansky T，et al．Evolution，W．H．Freeman and Company，San Franciscl，19772 李树深．分子钟．生物科学动态，1983，2∶13～213 Kimura M．The Neutral theory of Molecular Evolution，Cambridge University Press，Cambridge，London，New York，Rochelle，Melbourne，Sydney，19834 李树深．分子水平的分类学～～分子分类学，生物学通报1986，9∶4～65 Cann R L，et al．Mitochondrial DNA and Human Evolution，Nature，1987，325∶31～366 张亚平，等．大熊猫线粒体DNA九种限制酶图谱．动物学研究，1991，12∶209～214(云南大学李树深教授撰)