| 单词 | 免疫测定法在农药及其残留分析上的应用 |
| 释义 | 【免疫测定法在农药及其残留分析上的应用】 随着农药使用种类和数量的日益增多，它们对环境的污染直接或间接威胁着人类的安全。为了保护生态环境、维护公众健康，很多学者致力于寻找一种可靠、灵敏、实用的方法，以监测大气、水、土、食品等农药污染水平或残留量。目前，常用的农药分析法，包括比色法、紫外和红外光谱分析法、荧光光谱法、薄层层析(TLC)、气相色谱(GC)、气液色谱(GLC)、气谱／质谱(GC／MS)和高压液相色谱(HPLC)等，因灵敏度和特异性有限，或操作繁琐，不适于大批样品的常规筛检。免疫测定法(IA)集标记物(放射性核素、酶、荧光素等)测定的高灵敏性和抗体反应的强特异性于一身，用于某些重要生物活性物质(如蛋白质、激素、药物等)的痕量检测取得很大成功。1971年，Ercegovich最先讨论了农药DDT、马拉硫磷及氨三唑免疫测定。1980年，Hammock和Mumma综述了农药半抗原与蛋白质的连接及抗体的制备，推进了农药免疫测定法的研究与应用。近年来，国外农药分析专家们相继建立了放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)等农药免疫测定法。为了促进此项技术在中国的研究与发展，有必要对近年来免疫测定法在农药及其残留分析上的应用情况有所了解。 1．除草剂 2，4－D和2，4，5－T的RIA和ELISA：Rindcr和Fleeker将2，4－D和2，4，5－T的衍生物2，4－二氯－5－一氨基－苯氧乙酸经重氮化反应与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫原，制备免疫血清，建立2，4－D和2，4－T的RIA。对水样中两种化合物的检测限(LOD)分别为0．1ng／ml和20μg／ml，对2，4，5－T的专性强于2，4－D，因为前者与半抗原的结构更相似。该法虽不能区分两种除草剂，但避免GC分析中必须的提取和衍生程序，可作为表面水和地下水大批样品的筛检法。Hall等在Fleeker的基础上，用N－羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)和二环已基碳化二亚胺(CMS)将2，4－D与免疫血清白蛋白(RSA)连接作为包被抗原，建立2，4－D的ELISA，可测范围为100～10000ng／ml，变异系数(CV)＜7%。外加标准品于河水和人尿样中，无需纯化处理，测定回收率为82%～110%，与2，4，5－T、2甲4氯(MCPA)及2，4－D丙酸和麦草畏的交叉反应分别为15．6%、11．2%和5．6%，与2甲4氯丙酸无交叉反应。禾草灵(2，4－D苯丙酸甲酯，Diclo-fop-methyl)的荧光免疫测定(FIA)和酶免疫测定(EIA)：Schwalbe用CMC将2，4－D苯丙酸与BSA共价结合，保留了可能作为抗原决定族的2，4－二氯苯氧基部分，制备的抗血清对二氯苯氧基部分具有高度选择性，与2，4－D苯丙酸和2－甲氧基部分制备的抗血清对二氯苯氧基部分具有高度选择性，与2，4－〔4－(2，4－二氯苯氧基)－苯氧基)〕丙酸酯的交叉反应最强，与结构类似的除草剂2，4－D丙酸和2，4－D均无交叉反应。因为制备免疫原的半抗原为清旋2，4－D苯丙酸，所以产生的多克隆抗体不能区分禾草灵的立体异构体。应用处理的免疫原或单克隆抗体可望解决这种特异性问题。建立的FIA和EIA已用于多种样品(土、尿、血清、小麦、大豆和糖甜菜)的常规分析。样品经有机溶剂提取、蒸发后，残渣溶于缓冲液中，无需进一步纯化即可供试。其测定结果与GC或液闪计数一致。绿黄隆的ELISA：Kelley等将绿黄隆的重氮化衍生物与血蓝蛋白(KLH)或BSA偶联，分别作为免疫原和包被抗原；制备的抗体效价高，与两种结构类似物有交叉反应，但当修饰它们的臂桥或异环结构时，抗体就不再识别它们。ELISA的检测限为0．4ng／kg。样品制备简单，土壤的粗提液可直接用于分析，且适于各种理化特性土壤的分析。与具有相同灵敏度的HPLC相比，ELISA每天样品分析量(50个)可增加11倍。去草净的FLISA：它由Huber和Hock等建立。检测限为20pmol，相当于4．8ng，因为抗血清与羟基去草净有交叉反应(78%)，应用本法可同时测定去草净及其羟基代谢物，与其他S均三氮苯类除草剂，如扑草净及西玛津无交叉反应。与HPLC和GC相比，本法对水样无需任何前处理，测定简单、速度快。阿托拉津(莠去津)的EIA：Huber报道了阿托拉津的固相(聚苯乙烯微滴板)EIA，对水溶液样品不作前处理，可测范围为1．1～2200ng／kg。如采有聚苯乙燃微球代替微滴板，则检测限为11ppt；如用亲和层析法纯化抗体，则检测限为11ppt(微滴板)和0．1ppt(微球)。Bushway等和Reed分别应用商品ELISA KIT检测了水和土中阿托拉津的残留，检测限为1．0ng／kg，每天样品分析量＞50个，比GLC和HPLC速度快、灵敏、经济。百草枯(对草快)的ELISAVan：Van Emon等将半抗原百草枯的戊酸衍生物与KLH连接作为免疫原，制备免抗百草枯抗体建立百草枯的ELISA。对于大容量玻璃纤维空气滤片等样品用6NHCI提取、浓缩、离心，对于生物体液样品不需要纯化，检测限为0．1～1．0ng／ml(玻璃纤维空气滤片等)、2ng／ml(绵羊血浆)、9ng／ml(人尿)和0．7ng／ml(淋巴液)，批内CV＜4%，批间CV＜5%，特异性强，与乙基百草枯和离子敌草快的交叉反应均很小；与GC相比，ELISA的回收率高(75%～90%＞50%～75%)，因此，对于某些污染水平较低而用GC难以分析的样品，可改用ELISA测定。Van Emon等将ELISA用于食品中百草枯残留量的检测，对于马铃薯和牛肉用6N HC1提取(同玻璃纤维滤片样)，对于全脂和低脂牛奶用PBS(含Tween－20)简单稀释后即可进行分析。ELISA的检测限为1．0ng／kg(牛奶)、0．8ng／kg(马铃薯)和2．5ng／kg(牛肉)，低于光谱测定的10ng／kg。另外，ELISA仅需微量样品(0．5g)即可进行分析，而光谱测定则要50～250g。二者的回收率虽均＞75%，但一般情况下ELISA的回收率要高些。同样劳动强度下，FLISA的回收率要高些；同样劳动强度下，ELISA的每天测样量平均约为光谱测定的5～10倍。禾大壮(草达灭)的ELISA：Gee等将禾大壮的硫基丙酸衍生物通过混合酸酐法与KLH连接作为免疫原，制备免抗血清，建立禾大壮的ELISA。检测限为3ng／ml，与磺基禾大壮的交叉反应为15%，与其他硫赶氨基甲酸酯类除草剂的交叉反应均＜1．4%，加放射性14C－禾大壮于田水中，于不同时间采样，放射性测量结果与ELISA一致。对9个田水样作四平行测定，日内平均CV为7．8%，4日间平均CV为9．4%。对含量达ppm级的水样无需前处理，对含量低至ng／kg级的水样须经二氯甲烷提取、浓缩后，加入可与水相混溶的溶剂(如丙二醇、氰化甲烷、二甲亚砜等)中才能供试。Li研究了低水平污染的水样制备法，用C18固相提取室(SPE)，以乙酸乙酯洗脱提取，回收液加入氰化甲烷／丙二醇(1／1．V／V)中，进行ELISA测定。结果表明，SPE可使ELISA的检测限降至1．0ng／kg，如调整水和洗脱溶剂的体积，检测限还可进一步降低，与GC相比，SPE－ELISA的回收率和精密度略低些。杀草丹(稻草完)的ELISA：杀草丹和禾大壮同属硫赶氨基甲酸酯类除草剂。Cheung报道了它的ELISA，检测为1．0ng／kg。水样无需任何有机溶剂或SPE浓缩程序，可获得满意的测定结果。2．杀虫剂 狄氏剂和艾氏剂的RIA：Langone和Van Vunakis将狄氏剂和艾氏剂羧基类似物用NHS和DCC与人血清白蛋白(HSA)连接作为免疫原，制备抗血清，分别建立了狄氏剂和艾氏剂的RIA，对两种化合物的检测限分别为4．2pmol(水)和22．0pmol(水)，与异狄氏剂、t氯和氯丹有交叉反应，与其它氯化合物，如DDT、2，4，5－T和2，4－D无交叉反应。测定可区分狄氏剂与异狄氏剂，表明抗体特异性强。此外，抗体活性强，即使贮存10V，对狄氏剂仍有很高的亲和力。对硫磷的RIA：Ercego-Vich等将对硫磷的芳香硝基(RNO2)还原为芳香伯胺(R－NH2)，通过重氮化反应与BSA连接，制备免抗体，建立对硫磷的RIA，试样无需纯化，检测限为4ng(水溶液)和10～20ng(血浆和莴苣)。与还原型对硫磷的交叉反应较大，这是因为制备免疫原的半抗原即系还原型对硫磷，与对氧磷的交叉反应可忽略不计。对氧磷的EIA：了解对硫磷的代谢物对氧磷的血清水平，便于对中毒病人的治疗。Hunter和Lenz〔23〕建立了对氧磷的EIA，灵敏度为10－9M(血清)和28pg／ml(缓冲液)。Briemfield等建立基于单克隆抗体的对氧磷的EIA，虽灵敏度低于多克隆抗体的EIA，但特异性更强，多克隆抗体与对氧磷的水解产物对硝基苯酚和二乙基磷酸酯有交叉反应，而单克隆抗体则不存在这个缺点。伏虫脲(除虫脲)的ELISA：伏虫脲为昆虫生长调节剂，其ELISA由Wie等建立。样品(水、牛奶)无需纯化，对水和牛奶的取样量分别为0．5ml和0．2ml，检测限分别为1．0ng／kg和40．0ng／kg，回收率为100%，CV为3．5%，每天分析样品量＞50个，较GLC和HPLC灵敏、简单、经济有效。另外，因制备的抗体与BAYSIR8514有较强的交叉反应，所以应用本法可同时测定伏虫脲和BAYSIR8514。Wie等在研究本法的同时，曾试用14C伏虫脲进行RIA分析，但因所用放射性标记物的比活度太低，以致未能成功。Wie和Hammock在分子的不同部位和同一部位分别将伏虫脲与载体蛋白连接合成免疫原和包被抗原，不同部位连接的ELISA灵敏度高，对未作前处理的牛奶，检测限为2．0ng／kg，重复性好。硫丹的EIA：Dreher等将硫丹溶于无水吡啶中，与琥珀酸酐回流反应，合成硫丹半琥珀酸酯，然后用NHS和DCC使之与KLH连接作为免疫原，用羰基二咪唑制备硫丹－辣根过氧化酶复合物，作为包被抗原，建立硫丹的EIA。水溶液样无需任何前处理，可测范围为3～400ng／ml，与其他类似的氧代烃农药有交叉反应，其中异狄氏剂为180%、艾氏剂为16%、冰片丹为7%、林丹为3%。与异狄氏剂的高交叉反应百分率暂无法解释，提出只有进一步研制单克隆抗体才能解决硫丹EIA的特异性问题。氯菊酯的EIA：Stan-ker等制备抗除草虫菊酯单克隆抗体，发现该抗体对合成除虫菊酯类杀虫剂，如苯醚菊酯(醚虫菊)、氯菊酯、氯氰菊酯和Del-tamethirn有不同程度的识别能力，即对含有Phenoxybenyl结构和环丙烷环的化合物有交叉反应。研究人员用Py－1单克隆抗体建立牛肉中氯菊酯残留检测的EIA，可测范围为50～500ng／kg，灵敏度超过目前所允许的残留检测限(150ng／kg)。3．杀真菌剂 苯菌灵RIA：New-sone和Shields将2－琥珀酰胺苯并咪唑与HSA连接，制备MBC抗血清。建立食品作物中苯菌灵的RIA(实际检测MBC)，灵敏度为0．25～1．0μl／L。样品制备简单，植株用乙酸乙酯提取、蒸发供试。本法与液相色谱(LC)的测定结果具有良好的相关性(r=0．99)。因为样品制备所需的内容不同，LC法适于少量样品的确证，而不适于大批样品的常规筛检。RIA比LC法简单，分析速度约为后者的5倍。氨丙灵(瑞毒霉)的ELISA：它由Newsome建立，可定量测定食品作物的甲醇提取物，灵敏度为0．1～2．0ppm，准确性和精密度与GC法相当，与结构类似的除草剂草不绿及Diethatrl ethyl有交叉反应，虽特异性略低于GC法，但操作简单，每天测样量(36个)为GC法的4．5倍。三唑二甲酮的ELISA：Newsome〔31〕用硼氢钠将三唑二甲酮还原为其代谢物三唑二甲醇，与琥珀酸酐反应，生成琥珀酰三唑二甲醇，然后再利用水溶性碳化二亚胺(EDC)，使之与HSA共价结合，制备免疫原。产生的抗体对三唑二甲酮及其代谢物三唑二甲醇均有识别能力，而对另一种代谢物4－氯酚不识别。三唑二甲酮与三唑二甲醇的50%的抑制浓度(1C50)分别为2．4ng／ml和2．1ng／ml。样品用甲醇或乙醚提取，过滤液直接供试。与GC法相比，二者的回收率和重复性均相近，6个梨样各加0．5μl／L剂量，ELISA的CV为5．1%，略高于GC法(4．6%)，但分析速度快，远高于GC法。异丙定(咪唑霉)的ELISA：也由Newsome建立。样品用乙醚提取，无需进一步纯化；外加0．1～1．0mg／kg异丙定至4个商品中，回收率≥86%；其N／P的检测与GLC相关性良好；与异丙定的水解产物有交叉反应，对有关杀真菌剂烯菌酮和杀菌利的活性分别为异丙定的3．5和10倍。4．植物生长调节剂 抑芽丹(MH)的EIA：Harriison等将抑芽丹的4种乙酸衍生物与KLH或BSA连接，分别作为免疫原和包被抗原，建立基于单克隆抗体的两种EIA(均相和非均相EIA)烟草、马铃薯和洋葱等用甲醇提取，检测限为0．11～1．3mg／kg，非均相测定较均相测定敏感，提取液对测定无干扰。5．杀鼠剂 华法令(杀鼠灵)的RLAR或S－华法令属镜象异构化合物，二者的生物学和环境学特性差异较大。Cook等将R或S－华法令的羧基类似物BSA连接，合成免疫原。应用这些镜象异构复合物制备的抗血清，可选择性地与R或S－华法令结合。S－抗血清与R－华法令的交叉反应为0．3%，R－抗血清与S－华法令的交叉反应为3．3%。能区分异构体是本法的重要优点，本法的灵敏度为25ng／ml(血浆)。免疫测定法为灵敏、特异、准确、快速的痕量分析法，尽管ELISA的灵敏度有时尚不足以直接分析环境中某些低水平农药污染的样品，但通过对样品简单预处理(浓缩)可解决问题，与传统方法(如GC法)相比，免疫测定法样品制备简单，无需繁琐的分配和层析纯化程序，省时省力，经济有效，对一些传统方法难以分析的极性一离子化合物及其残留物的检测意义更大。然而，免疫测定法尚存在一个不容忽视的问题－特异性。很多方法在建立过程中是利用某种农药的母体或代谢物作为半抗原、合成免疫原、制备抗体的。这种抗体虽对农药本身有选择性，但对其母体或代谢物亦有较大的交叉反应。因此，研制专性更强的抗体(如单克隆抗体)是今后的努力方向。(南京农业大学同位素应用教研室黄世乐副教授、陈祖义教授撰) |
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