| 单词 | 水稻分子生物学研究 |
| 释义 | 【水稻分子生物学研究】 早在1968年莎瓦(H．Sawai)等首次分离提纯了谷蛋白，至1976年居朗诺(B．O．Juliano)分离了该蛋白的3个分子量分别为38、25和16ku的亚基。此后，水稻分子生物学主要围绕贮藏蛋白、细胞器(线粒体、叶绿体)基因组、农艺及生理生化性状、分子标记和核基因组开展卓有成效的研究，旨在分离相应的基因或DNA片段，研究基因的结构和功能。 谷蛋白占水稻籽粒蛋白的80%，自赵(W．M．Zhao)等1983年测定了谷蛋白的部分氨基酸序列后，1985年日本农业生物学研究所首次成功地分离出谷蛋白编码基因。1987年高岩等从乳熟胚乳中获得2类谷蛋白cDNA克隆，其内切位点的多态性不一样，但编码区95%是同源的。其中一个克隆为1622bp，编码一个499个氨基酸的谷蛋白前体，包括24个氨基酸的信号肽，279个氨基酸的酸性亚基和197个氨基酸的碱性亚基，另一个克隆也编码相同数目的多肽。不同稻种的谷蛋白的亚基存在分化现象，1990年中国吴欣康等在野生稻种中发现各有1～5类基因编码谷蛋白。除了谷蛋白外，对另一些贮藏蛋白如醇溶谷蛋白，球蛋白等也作了研究。1989年南朝鲜的金(W．T．Kim)等克隆了2类醇溶谷蛋白的基因，两者75%是同源的，主要由短核苷酸序列的插入／缺失和点突变形成，该蛋白也由多基因簇编码。同年，满川(N．Mituskawa)等探明了球蛋白前体氨基端的信号序列，为进一步作分子分析奠定了基础。水稻线粒体和叶绿体的遗传结构一直受到研究者们的重视。尤其是线粒体DNA(mtDNA)与胞质雄性不育(CMS)有关，研究较多。早在70年代，复旦大学生物系就着手对杂交稻三系的mtDNA翻译产物进行研究，发现不育胞质的mtDNA存在缺陷，蛋白产物有差异。1989年刘祚昌等发现BT型不育细胞质的mtDNA产物比可育胞质少一个22ku的多肽。恢复系的核基因可产生该多肽而弥补mtDNA缺陷。至1990年日本名波等克隆了不育系线粒体拟质粒B1和B2，发现在胞质的育性回复中，mtDNA和核DNA结构发生变化。杂交稻三系的PsbA基因已被克隆，其启动区序列有差异。也克隆了不育系和保持系线粒体的atPA基因，不育系有2．9Kb和3．5Kb的2个片断，保持系只有3．5Kb的片段，推测不育系可能有2个atPA基因拷贝。此外，水稻线粒体的cob、cox和atp9基因已经定序，且与玉米基因高度同源。从遗传结构上来说，水稻mtDNA由5种基本环状的DNA所组成，每一种环状均有与其它环状DNA同源的部分，可构建一个492Kb的主环。已经注意到水稻不同亚种间的mtDNA各有进化上的特点。籼稻和粳稻mtDNA的酶切位点存在相当大的差异。在组织培养中，mtDNA也发生变异或重排。水稻叶绿体DNA(ctDNA)的遗传结构首次于1985年由日本平井等所揭示，构建了Pvn Ⅱ、Pst1、Sal Ⅰ3个限制性内切酶的限制图谱。为一个环状的DNA分子，包括一个大的单拷贝区和一个小的单拷贝区。1991年中国赵衍等构建了水稻叶绿体Cosmid文库，制作了更为精细的6种限制性切酶的限制图谱。水稻ctDNA的全长约129．5～134．5Kb，包含91个基因，3个拟基因和36个开放读码，编码约80个蛋白质。已定序了其中一些原因：PasA-PasB-rpsl4基因，光合系统ⅡA－B光接收蛋白基因，RNA聚合酶基因等。大部分叶绿体基因在幼叶中能表达，有的基因只产生一个转录子，有的则产生多个大小不同的转录子。当前和今后线粒体和叶绿体的研究重点在于探明基因的功能及其调控，并分离某些重要的基因。水稻核基因组控制的重要农艺和生理生化性状的分子基础普遍受到重视。早在1984年日本佐野发现非糯性基因(Wx)编码一个64ku的蛋白，而糯质基因(Wx)不产生该蛋白。该基因表达具有组织专化性，即在花粉粒和籽粒中表达。目前已了解Wx基因的序列，与玉米的Wx基因高度同源，全长为5499BP，产生2．4KB的转录子。Wx基因的不同突变体表达产物有差异，但基因的5．5KB的结构区在不同突变体间是高度保守的，突变可能发生在结构区的外部。水稻籽粒中参与碳水化合物代谢的一个重要的酶是α－淀粉酶。1991年沙德利夫(T．Sutliff)等分离出8个不同的α－淀粉酶基因即RAmy1A、2A、3A、1B、3B、3C、3D和3E。这些基因片段长度约为5KB转录方向相同。其中3A、3B和3C和内含子很小，翻译的酶蛋白高度同源。从胚和糊粉层中提取这些基因的mRNA，发现有组织特异性，基因3B、3C和3E主要在糊粉层中表达，1A、1B和3D在胚和糊粉层中均有表达，2A、3A基因在这些组织中都不表达。目前这些基因的染色体定位和序列分析已经完成。水稻株高迄今已知共有51个以上基因控制，生产上应用的品种绝大多数为半矮生sd1基因的分子学研究最近才有所进展。1991年中村等发现1个与sd1紧密连锁的Srp点，编码2个分子量均为32ku，但等电点分别为7．4和7．7的糖蛋白(SRP－1，SRP－2)。可能与植株的早期发育有关。期望通过如染色体巡查方法分离sd1基因。水稻另一类雄性不育性：光(温)敏核不育性(HPGMR)首次于1985年在中国发现，并应用于杂交水稻获得成功，对此特性的分子学水平的研究相应受到重视。1990年岳彬彬等人构建了HPGMR基因文库，为进一步分离核不育基因打下了基础。核不育性的机理方面，已明确不育系总RNA含量在长日照条件下明显减少。光周期可能在转录水平上起调控作用。发现在不育系农垦58s的线粒体中和胞质中存在双链RNA(dsRNA)，与不育性有关，长度约为18Kb。这种dsRNA在BT型胞质不育系中也均有发现，引起了研究者们的极大兴趣。已经了解不育花药中ATP含量明显低于可育花药，RuBP羧化酶、GOD、NR、ADH和Est的活性高低与可育花粉率密切相关。水稻核不育性的利用也促进了亚种间广亲和性的研究，广亲和品种具有一条特异的酯酶带(10A)，由E·β1基因编码，可作为亲和性的标记。已分别从籼稻和粳稻中筛选出了几个广亲和性的阳性克隆。对核不育和广亲和性的分子机理正在作进一步研究。理论和实验技术的发展，使研究者们得以直接从分子水平上探索水稻生理生化特性的本质，并进一步分离相应的基因，构建水稻的基因文库。除了上述已分离的基因外，迄今已克隆的其余22个酶(蛋白)基因见表1。在这方面美国康纳尔大学的工作较为出色。此外，对水稻逆境反应的分子学也有突破性进展，1990年克莱斯(B．Claes)等分离出一个对盐和干旱响应的基因，编码一个分子量为15ku、等电点为5．5的蛋白质。1991年高贺一坂发现在冷激情况下，Poly(A)RNA体外翻译产物发生变化，产生了几个新的多肽。其中14ku的一个多肽有5℃处理下强烈地诱导合成。为逆境响应的分子机理研究奠定了基础。一些学者则致力于特异性DNA结构的研究，其中较有成就的工作是发现水稻中有不同拷贝的DNA序列，水稻基因组≥90%为单拷贝，存在转座因子，及在多个稻种中均有352BP的顺接重复序列。水稻同功酶作为一类标记性状一直被应用于稻种分类、遗传研究和育种工作。至今已鉴定出13种同功酶共30个位点。在染色体上多数位点是独立的，也有一些是连锁的。作为另一类分子水平的标记，目前研究最为热门的是限制性片段长度多态性(FRLP)，用于染色体作图，研究物种进化和分类，直至分离和克隆重要的基因。最早于1988年由美国康纳尔大学的麦考西(S．R．McCouch)等构建了12个染色体的1386cM的FRLP图，表明水稻中有大量RFLP变异，大部分RFLP源于插入／缺失。之后，水稻的FRLP在美国、日本、中国等迅速发展起来，旨在构建水稻基因图谱，并与某些重要的农艺性状联系起来。已建立与RFLP连锁的基因有抗瘟性、抗白叶枯病、抗白背飞虱、籽粒香味，光周期反应，半矮生性等11个基因。此外，对ctDNA和mtDNA的RFLP分析发现ctDNA比mtDNA较为保守。用PCR技术扩增DNA片断进行FRLP分析可不再利用传统的Southern杂交和放射性标记技术。至今水稻的RFLP图已扩展到322个标记，覆盖的基因组达2500cM以上。目前正进一步构建饱和的FRLP图，并借助于分子图谱分离重要的基因和测定水稻基因的全序列。这将是今后水稻分子生物学发展的一个重要途径。【参考文献】：1 Takaiwa F，et al．A rice glutelin gene family～a major of glutelin mRNAs can be divided into two lines．Molecular and General Genetics，1987，208：15～222 McCouch SR，et al．Molecular mapping of rice chromosome．TAG，1988，76：815～8293 刘祚昌，等．水稻线粒体翻译产物和细胞质雄性不育．遗传学报，1989，16：14～194 Pham JL，et al．Isozyme makers in rice genetic analysis and linkage relationships．Genome，1990，33：348～3595 赵衍，等．水稻叶绿体基因文库的构建和精细限制图谱的制作．遗传学报，1991；18：149～1606 Hirano H，et al．Molecular Characterization of the waxy locus of rice．Plant Cell Physiol．1991，32：989～9977 Koga-Ban Y，et al．Alteration in gene expression during cold treatment of rice plant．Plant Cell Physiol． 1991，32：901～905(浙江农业大学何祖华博士撰) |
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