| 单词 | 植物细胞组织培养技术在筛选抗病突变体中的应用 |
| 释义 | 【植物细胞组织培养技术在筛选抗病突变体中的应用】 随着植物离体培养和突变体鉴定方法的改进，利用细胞和组织培养技术筛选抗病突变体已成为植物细胞工程的一个研究领域。与常规育种方法相比，离体筛选具有以下优点：(1)可以获得广泛的变异类型，甚至产生自然界尚未发现的突变，为选择抗病品种提供丰富的遗传基础；(2)可以在较小空间内培养与处理大量细胞；(3)在细胞水平上直接诱发与筛选突变体，是高等植物抗性育种微生物化的一种尝试，易于从单倍体细胞选出隐性突变，经加倍成二倍体或双倍体，较快地得到纯合稳定的抗病材料；(4)在人工控制条件下体外定向选择，易于进行同位素示踪、半微量分析等试验，不受地区与季节限制；(5)可以从细胞、组织及整株水平上进行生化、遗传及抗病机制的研究。 1973年，Carlson以烟草野火病毒素类似物MSO(酸)为选择剂，从经EMS处理的烟草原生质体和细胞培养物中筛选出抗性突变体。之后，许多科学工作者用类似方法，以活菌、毒素及其结构类似物在甘蔗、马铃薯、小麦等多种作物上进行尝试，相继筛选出一批抗病突变系及其再生株。另外，对番茄的Alternaria solani(Shepherd，1986)和Fusarium oxysporum(Hartman，1984)、苜蓿的Stemphylium botrysum(Barash，1982)、天竺葵的Xanthomonas campestris(Ham-merschlae，1982)、珍珠粟的Claviceps fusiformis(Bajaj，1980)、洋葱的Perresri(Gourd，1986)等病害，也进行了抗毒素突变体的筛选工作。细胞组织在不同于体内发育条件下进行离体培养，不受植株整体调控，而直接接触环境，培养基中的有机、无机化学环境与激素都可能含有诱变因素或是促进突变的条件，外植体体细胞遗传组成的多样性也是产生变异的重要原因。植物细胞组织培养物遗传物质的变异主要有：(1)细胞内DNA重复复制，形成多倍体；(2)三极或多极纺锤体形成，产生染色体畸变；(3)染色体断裂与重组，产生染色体畸变；(4)基因突变，从而为抗病选择提供广泛的遗传变异类型。尤其在加入选择剂之前对培养物进行诱变处理，可大大提高变异率和扩大变异谱。以致病物质为选择剂进行定向选择，可以获得突变的抗性细胞。许多作物的实验结果表明，利用组培技术在细胞水平上筛选的突变体，与田间植株的抗性有一定的相关性，因而可望通过离体筛选获得抗病突变体。为使筛选抗病突变体得到较理想的结果，除注意选择被处理的对象及其生长状态外，还要考虑病原菌素保持稳定、抗病性鉴定标准及一整套筛选程序等因素。以上各项措施实质上是一个严密的综合体，其中任何一个因素变动，都会严重影响筛选效果。目前国内外对植物抗病离体筛选的研究主要集中于以下几个方面：植物材料的选择与诱导 获得较高的诱导分化率是组培筛选抗病突变体的先决条件。中外学者对影响再生株诱导频率的诸多因素，如外植体材料(基因型、取材时间)、培养条件(培养基种类及附加成分、H+浓度、培养温度、光强、光质、光照时间、培养过程中愈伤组织的选择及适宜的培养历期)和单倍体加倍技术进行了大量研究，并对愈伤组织和胚状体的结构、发生途径及白化苗成因进行了探讨，摸索出多种作物不同外植体较适宜的培养基和培养方法，提高了得苗率，扩大了组培植物的种类，过去难以组培的小麦，现在用幼胚、幼穗、花药、成熟胚、胚轴、子叶、生长锥、茎、节等外植体都成功地获得了再生株。组培技术日趋成熟，为离体筛选奠定了良好的基础。抗病突变体筛选系统 (1)无压选择系统。培养基内不施加选择压力，只是利用培养过程中产生的体细胞无性系变异在形成再生株后，用病菌接种鉴定抗病株。此法可用于筛选不能用培养基培养或不能产生毒素的病菌抗性突变体，但因无选择压力，中途不淘汰，群体较大。(2)正选择系统。在培养基中加入致病物质(活菌、毒素或其结构类似物)杀死正常的不抗病细胞，仅使抗病细胞再生植物。(3)“绿岛”选择(原位选择)。在经诱变处理的单倍体植株叶片上接种病毒或专性寄生真菌，叶片因感病褪绿，但突变的抗性细胞仍保持绿色，一段时间后，抗性细胞扩增到一定范围，叶片上便出现绿色的正常组织斑块(“绿岛”斑块，即抗生细胞区)，将它取下组培再生植株，进一步接种鉴定，可选出抗病植株，此法只适于能将叶片细胞培养成再生株的单倍体，且需要较大的供选群体。对抗病机制的研究 根据“基因对基因”假说，有人提出，病原菌及其毒素通过与感病的寄主细胞中相应受体或敏感位点结合，从而导致细胞结构的破坏和代谢途径的改变，最终表现为病害症状。Strobel(1973)和Gary(1975)从感染眼斑病的甘蔗细胞膜上分离出病原菌毒素长蠕孢糖苷的蛋白质受体，这种毒素——蛋白质受体复合物能使甘蔗和烟草抗病品系的原生质体被毒害致死。Sheffer发现，维多利亚长蠕孢毒素能影响感病燕麦原生质膜的透性，使原生质体迅速破裂，但对离体细胞器没有影响，因而推论原生质膜是毒素的作用位点。一般认为，小麦根腐病毒素和玉米小斑病T小种的作用位点在线粒体膜上。病毒、毒素侵入后，常引起寄主细胞代谢的改变。如细链格孢毒素影响黄瓜叶绿素的形成(Stempleten，1978)，玉米小斑病长蠕孢毒素使T型胞质不育玉米的氧化磷酸化解偶联(Miller，1971)。毒素的制备及生物测定 许多作物的实验结果表明，寄主对病原菌的感病性与对毒素的敏感性呈正相关，细胞水平上对毒素的抗性与田间抗病性呈现一致的趋势，为保持实验的一致性和重演性，筛选过程中应尽量使用稳定一致的毒素。目前的制备毒素主要来源于活体上培养物(病叶提取液)和活体外培养物(培养滤液)，制品有培养滤原液、精提毒素、粗毒素等。许多学者探讨了影响毒素制备与保存的因素，使毒素生产越来越符合生产需要。测定毒素活力时主要用生物测定法。常见的是测定毒素对种子发芽、根的生长、叶片病斑数、原生质体存活率的影响。Hawes提出的诱致离体根冠细胞死亡测定法比较准确，但不如测定对器官的抑制作用简便易行，故应用较少。1981年，Larkin用电阻法测定了甘蔗对眼斑病毒素的敏感性。后来证明，许多植物对病菌及毒素的抗性与电阻值大小呈正相关。此法灵敏简便，重复性好，测定条件容易实现标准化，几经改进，已成为测定毒素效价与细胞、植株抗病性的快速方法，提高了组培程序下的筛选效率。其原理是，正常细胞的膜系统具有较高的电阻值，当它受到病原菌及其毒素伤害时，生物膜构型发生改变，膜透性增强，电解质外渗，电导增大，从而降低受害组织的电阻。细胞受害越重，电阻值降低越甚，因而电阻值可作为细胞伤害的指标。筛选方法 常用的有两种：(1)一步选择法。用较高浓度的毒素(或病菌)一次有效地杀死或抑制所有无抗性细胞。此法多得到隐生的单基因突变体，但往往不易发现微突变。(2)多步选择法。逐步递增毒素(或病菌)浓度，经多轮选择，得到细胞突变体。此法易在生化环境不详的材料中得到多基因突变体，但筛选时间较长，常会严重降低愈伤组织的分化能力。组织培养与诱变处理结合筛选病突变体 培养前或培养过程中，对外植体或愈伤组织进行诱变处理，可提高变异率，扩大变异谱。常用的物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线和快中子。紫外线为非电离射线，穿透力弱，常用作单细胞诱变剂。其余均为电离射线，可用于多细胞材料的诱变。其中γ射线应用最广。常用的化诱剂有甲基磺酸乙脂(EMS)、硫酸二乙脂(DES)、乙烯亚胺(EI)、叠氮化钠(NaN3)等。化诱剂能诱发离体细胞较多的点突变，获得较高的突变率，理化因素复合处理能得到广谱的突变。诱变处理时既要考虑其对无性系增效作用的大小，还要注意不使培养物诱异分化率过度降低，以提高其实用价值。可将经诱变处理干种子等获得的M1代植物组织作为外植体，也可直接处理外植体或愈伤组织。因辐射具有间接效应，辐照培养基中的营养物质，也能提高其细胞培养物的突变频率。诱变处理单倍体细胞，其突变性状在当代再生株上就能表现出来，便于鉴定与选择。抗病突变体的鉴定与遗传分析 细胞在离体筛选过程中，常发生适应性变异，这些变异随选择因素的消失而消失。只有对细胞水平上选出的变异体进行温室和田间发病鉴定，才能选出抗病再生株。这些抗病再生株还需通过有性世代，淘汰那些由于环境条件改变而引进的表型变异，选出抗病性能通过有性传递的真正突变体。最后还要通过突变体自交或与野生型杂交，根据后代表型及分离比率确定基因突变的类型(质基因突变还是核基因突变)和遗传方式(单基因还是多基因突变)。生化分析是研究基因作用机理的重要手段。目前主要是分析抗病体与对照同工酶谱及酶活性的异同，来确定是否真正发生了突变和突变的遗传基础。郭丽娟发现，选出的抗玉米小斑病突变体与不抗病对照的胚性细胞团及再生株叶片的过氧化物同工酶酶谱有明显差异。不抗病植株的酶活性强，酶带多而颜色深。有人发现，小麦抗根腐病突变体的苯丙氨酸裂解酶活性高于对照，醇溶蛋白电泳图谱中突变体低分子量部分增加了一条谱带。利用细胞组织培养技术筛选植物抗病突变体，目前仍处于探索阶段，直接在生产上应用尚有不少困难，应加强以下诸方面工作：(1)进一步提高培养技术。(2)完善抗病突变体的筛选方法。(3)深入研究细胞突变和抗病机制。(4)综合考虑抗病筛选与其它性状的关系。离体筛选抗病突变体已取得可喜成就。随着筛选技术的改进和抗性机理的深入研究，这一技术必将在作物改良方面日益显示出它的重要作用。【参考文献】：1 Carlson P S．Science，1973，180：1366～13682 刘国胜，等．河北农业大学学报，1990，13(1)：104～1083 高明尉，等．中国农业科学，1987，20(1)：25～314 张冬生．植物体细胞遗传学．上海：复旦大学出版社，19895 郭丽娟，等．遗传学报，1987，14(5)：355～3626 梁竹青，等．作物学报，1988，14(2)：132～1427 Strobel G A．J．Biol．Chem，1973，248：1321～13268 董金泉，等．河北农业大学学报，1988，10(1)：95～999 Larkin P J，et al．Plant Physiology，1981，67：408～41410 Damann K E，et al．Phytopathology，1974，64：652～65411 Chawla H S，et al．Plant Breeding，1987，99：159～163(中国科学院遗传研究所李社荣撰) |
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