【烟草原生质体培养】
烟草原生质体培养早在1970年Nagal和Takabe第一次由烟草的原生质体培养成再生植株，使原生质体培养的研究很快发展起来。由于每个植物原生质体都含有该个体的全部遗传信息；能得到大量遗传上同质的再生植株；能超越性细胞的不亲和障碍、进行各种远缘种间体细胞杂交；能摄取外源遗传物质，是进行遗传转化的理想工具。烟草的原生体培养研究领先于其他作物，可作为其他作物原生质体培养研究的模式。
烟草原生质体培养成再生植株的种至今已有16个种。1970年美国Carlson用NaNo3作融合剂，诱导粉蓝烟草(N．glauca)和郎氏烟草(N．logsdorffii)叶肉原生质体融合，获得烟草种间体细胞杂种植株。Kao和Michayluk(1972)用聚乙二醇(PEG)作融合剂，使原生质体融合频率明显提高，他们把PEG和高钙高PH液结合起来，使大豆和粉蓝烟草的原生质体融合率达到10%～35%。龚明良等1980年用Kao的方法获得普通烟草
黄花烟草，普通烟草
粉蓝烟草的体细胞杂种植株，对杂种后代的观察已至第10代，从用普通烟草作回交亲本的杂种后代中选出几个稳定株系，从中选出两个进入田间试验的新品系。李向辉等利用烟草冠瘿瘤B6S3细胞系和矮牵牛W43的原生质体为材料，用PEG进行融合，获得属间体细胞杂种植株。至今烟草种间体细胞杂种植株有12个种，属间杂种有3个。原生质体是一个理想的单细胞系统，又没有细胞壁，进行诱变处理具有明显的优点。1973年美国Carlson将烟草野火病毒素类似物加入培养物中，筛选出抗毒素类似物的细胞系，并分化出抗野火病植株。烟草原生质体培养的主要技术路线如下：1．原生质体分离。烟草细胞跟其他植物细胞一样，外面包着一层坚硬的细胞壁，为了除去这层壁、除初期用机械分离法外，现在多数采用酶法分离原生质体。由于原生质体再生的第1个烟草植株是来自烟草的叶片、一直沿用至今。由于叶肉细胞分离原生质体的主要优点是来源方便、供应及时、有明显的叶绿体存在时，也便于在融合中识别。供体组织经酶处理后得到一种原生质体和未消化的细胞和细胞团及破碎细胞等的混合物，因此需要提纯。方法是：过滤－离心法，此法简便、易收集大量原生质体。其步骤是：第一步，把原生质体悬浮液通过240目筛网，孔径为40μm的过滤器过滤，除去未消化的细胞，细胞团和维管束组织等。滤液中含有原生质体和细胞碎片。第二步，低速(100×g以下)离心数分钟，使原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中。吸去上清液，把沉淀在管底的原生质体再悬浮于与酶液同等渗透压的洗液中，再低速离心，如此反复3～4次。第三步，将沉于管底的原生质体用培养基进行悬浮。操作时要特别小心，因离心和悬浮时用力稍猛，就会使原生质体破碎，影响得率和活力。2．原生质体培养。(1)烟草原生质体培养方法多数采用液体浅层静置法，也有用固体平面法和微滴培养法的。普遍采用NT和D2培养基(表1)。(2)原生质体的分裂和再生。烟草原生质体培养1～2d后，首先增大体积，膨大，叶绿体重排于细胞核周围。此时，如用荧光白染色，在荧光显微镜下可见到白色荧光围绕细胞外表，证明细胞壁已经形成。也可以高渗液产生质壁分离的方法来证实新壁的存在。细胞分裂第一次细胞分裂依赖于壁的形成，在培养2～3d后，胞质增加、细胞器增值、RNA蛋白质及多聚糖合成增长，不久即可发生核的有丝分裂及胞质分裂。多数情况下，健康原生质体培养2～7d，发生第一次细胞分裂，随后分裂更快，导致多细胞团。从原生质体形成的小细胞团或愈伤组织，当转移到固体分化培养基上后，就开始形态发生而逐渐长成完整的植株，需时60～80d。烟草原生质体在培养过程中辅以弱光照，培养室的温度以28℃为最合适。表1 烟草原生质体培养常用的培养基
(中国农业科学院烟草研究所卜锅章、丁昌敏、姚绍满、张历历撰；龚明良审)