【染色体端粒】
端粒构成直接生物染色体的天然末端。20世纪40年代，人们发现其对于染色体的稳定有着十分重要的作用：X射线辐射能引起染色体突变。但有染色体末端区域却很少有缺失与倒位等现象发生；当染色体发生断裂时，其断端不同于天然末端，具有粘性，能在断端处发生融合，形成多着丝点的环状或串状等畸形染色体(M．J．Muller，1938)。端粒被看成是染色体的重要结构之一，然而人们对它的结构却一无所知，随着分子生物学的发展和对DNA复制机制研究的深入，端粒问题又再一次从分子水平上提出来。DNA复制的起始是由RNA聚合酶在起始因子的作用下与DNA母链结合，合成一段RNA引物，提供一个3′端羟基，这样DNA聚合酶才能够接着这条引物对线链进行延伸复制。当链复制延伸反应启动后，5′端的RNA引物便被降解掉，在新链的5′端就留下了一段空缺而无法填补，因为任何DNA聚合酶都不能从线性DNA的5端部起始合成一段DNA链，而只能从已有链的3′－OH端使链延伸。这样随着细胞的分裂，DNA每复制一次，母链5′端与RNA引物结合的那一段DNA无法拷贝到子链中去，势必造成DNA链愈来愈短，遗传信息不断丢失。这就是Watson(1972)首先提出的DNA末端复制难题。 原核生物如细菌将自己的DNA永久性环化，这种首尾相连的形式使新链的3′－OH端继续向前延伸，而补上RNA引物被消除后所留下的空缺。λ噬菌体DNA虽是一个线性分子，它的两个5′端都有一个12b．p．长的单股互补突出，一旦它感染细胞后，就能借助互补突出暂时环化，达到完全复制的目的。许多动物病毒DNA也为线线，它们以核酸多联体方式复制或末端过剩等机制克服了DNA复制的5′端缺失(潘惟钧，1986)。真核生物的染色体DNA都是线性分子，其完全复制方法直到70年代末发现端粒的分子结构，才被真正搞清楚。尽管端粒的概念是在研究高等生物时提出的，但真正弄清它的分子结构却是在单细胞的原生生物中完成的。1978年E．H．Blackburn等发现凹膜虫rDNA分子末端是一连串的六核苷酸重复。一般可达几十次，总长度为370～520b．p．并发现四膜虫不同株之间以及不同种之间的rDNA末端结构完全一样，而且这种重复序列总有着某些特性。四膜虫端粒DNA结构的发现导致了许多其他物种染色体端粒结构的相继发现。由表1中可以看出，端粒DNA序列广泛存在于真核生物的染色体末端，而且它们基本上都有着与四膜虫端粒序列相同的特点，例如总有一条链富含有G，其5′→3′方向总是指向染色体末端，且比反向连长出若干个核苷酸而造成一种末端突出等。E．Henderson等(1987)用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，吸热变性分析，以及1H和31P的核磁共振光谱分析了端粒的顶端结构，证实其顶端由于DNA链的回折而形成了一个发夹形结构，且这一特殊的结构是由于G－G配对所造成的，为氢链所稳定。G－G配对是不遵循Wat-son-Crick的G－G配对规律的，富含G链的这些特性对于端粒DNA的复制有着重要的意义。在细胞中，端粒DNA总是和非组蛋白成分的蛋白质结合，形成一个复合体，构成染色体或染色质的天然末端。这种DNA和蛋白质的复合体常常表现为典型的异染色质或构成染色体的末端结节(E．H．Blackburn，1984)、1986年E．D．Gottschling等在尖毛虫Oxytricha中发现了与端粒DMA结合的特异性蛋白质，其分子量为55kD，26kD，它们与端粒DNA结合，这种结合能抗高盐抽提和核酸酶的处理：但对蛋白质变性剂敏感，因此推测这种结合是紧密的非共价结合。M．K．Raghuraman(1989)发现尖毛虫Oxytricha的端粒蛋白能与端粒DNA在体外组装成复合体，并推测出了端粒DNA与端粒蛋白的结合模式。原生动物学的研究表明：纤毛原虫(如四膜虫、游仆虫)都有两个细胞核，大核为营养核，基因活跃地转录，负责着体的表型特征；小核是生殖核，其基因不表达，负担着种质遗传，在有性生殖(接合)的过程中，大核是由小核发育而成。发育时，小核的单拷贝rRNA基因被剪切下来成为染色体的游离基因，经过扩增和多倍化，最后的rDNA分子多达1万个。分析这些rDNA分子，其末端都具有端粒序列即为(GGGGTT)n的六核苷酸重复片段，而从小核rRNA基因两侧则找不到相应的重复片段的模板，很显然，这些末端重复并非小核遗传的，而是在大核发育过程中添加到染色体两端的(B．O．King等，1982)。1984年J．Shampay等为了研究酵母染色体的端粒结构，构建了一个线性DNA质粒，这个线性质粒的一端带有四膜虫的端粒重复(G1－3T)，另一端带有四膜虫的端粒重复(G4T2)。当这个质粒转化酵母后，发现经过扩增，原有的四膜虫端粒序列仍都保留着，但在其后面(最末端)又加上了酵母的端粒重复。因而推测端粒的复制是一种无模板复制，并猜想有一种具有末端转移的活性的物质负责着将端粒DNA片段加到染色体上。以此为契机。Blac-kburn实验室利用四膜虫的无细胞抽提物在体外进行了端粒“加尾”实验。用合成的四膜虫未端重复(G4T2)4做为引物，并加入同位素标记的dGTP和dTTP，发现四膜虫的抽提物能使引物向前延伸上百个核苷酸，而且是以每6个核苷酸为单位延长。如果加入的是酵母端粒序列，则“尾巴”上加上的仍是四膜虫的端粒重复。若用PBR片段做引物，不能使链延长。用四膜虫端粒DNA的另一条链(CCCCA－A)4做引物，也不能加尾。当把反应基质加热至90℃或白酶处理，即失去活性。因而得出了许多重要的结论：端粒的加尾方向是按富含G链的5′端到3′端，每次是以TT－GGGG为一个单位重复加上的；它是无模板重新合成de novo synthesis；能特异性识别拟被加尾的末端序列；是一种蛋白质的酶所催化的反应。并把这种酶称为端粒转移酶，现简称端粒酶。表1 不同物种的端粒重复
C．W．Greider等(1987)对四膜虫的端粒的蛋白进行了分离纯化。该酶的分子量在200～500kD之间，如此大的分子量，以及对RNA酶的极为敏感性，说明了端粒酶是一种RNP结构。1989年C．W．Greider等又对端粒酶中的RNA成分进行了克隆和序列分析，发现端粒酶RNA是一个159碱基的小RNA，其中46、47和48位的核苷酸被修饰过，而这一位置恰恰有CAACCCCAA的序列结构。用反义RNA封闭该区域，能抑制端粒酶的活性，从而提出了端粒酶RNA的CAACCCCAA序列是该酶的一个活性位点，并为合成TTGGGG的端粒重复提供模板。1990年余国良等对四膜虫端粒酶RNA的基因的核心序列5′CAACCCCAA3′进行了点突变，后将其插入质粒转化四膜虫，果然发现受体细胞后代的染色体两末端出现相应突变的端粒序列，从而以实验遗传学方法在基因水平上证实了端粒酶RNA的核心序列是拷贝端粒DNA的模板。从游仆虫的端粒酶中发现了相似的核心RNA片段CAAAACCCCAAAA以做为游仆虫的端粒重复GGGGTTTT的合成模板(E．H．Blaekburn，1984)。端粒酶合成端粒DNA端粒必须有3个步骤；(1)端粒酶对已有的末端的识别和结合。(2)根据内设的RNA模板添加互补的核苷酸并聚合。(3)移位使端粒重复得以连续拷贝。端粒酶能移“自主”地对端粒DNA的G富含链进行加尾延长，而G－富含链又能通过G－G配对使其终端形成回折，这样DNA复制时，新链5'端缺失就可以得到补齐。这就是其该生物解决DNA末端复制难题的方法。端粒DNA总是和非组蛋白紧密结合，四膜虫大核DNA的(G4T2)。重复片段不能被小球菌核酸酶所消化。这种受保护的片段长度可达300～400b．p．，并且是作为一个整体受到保护的。所以端粒DNA并不形成核小体结构(E．H．Blackburn等，1981；M．L．Budarf等，1986)。游仆虫和尖毛虫的端粒结合蛋白已经被找到(D．E．Gottschling等，1986；M．K．Raglh Raghuraman等，1989)。这种核酸与蛋白质的结合关系可以从许多种生物的染色体制片中看到，用蛋白质银染的方法对粗线期的人卵细胞染色体进行染色，发现端粒部位出现浓染，而其它部位出现不完全染色或不染色(N．O．Haslit和R．C．All Shire；1989)。瓜蟾灯刷染色体中也能见到顶端有球形结节的结构(H．G．Collan等，1987)。这些端粒蛋白质就象两顶帽子盖在线性DNA4两端，使其末端具有隋性，保持着遗传系统的稳定，并有可能参与染色体的空间组织。无论是同源染色体还是异源染色体，它们的端粒常常会发生暂时的并合。第1次减数分裂前期，端粒聚集在一起，并处于核膜周围，这样染色体就呈现出“花束”状排列(A．Lima-de-Fana，1983)。双翅目染色体的双线期，异源染色体相互配对(异位配对)时，端粒的并合参与了这一过程的发生(T．Hinton，1945；G．M．Rubin，1978)。人卵细胞的粗线期染色体(联合复合体形成的早期)，染色体的配对首先发生于染色体末端的端位置(N．D．Hastic和R．C．Allshire，1989)。爪蟾的灯刷染色体末端也出现相互融合现象。(H．G．Callan等，1987)。洋葱根尖细胞间期染色体的端粒似乎是以成对的方式相联合(C．A．Fussell，1975)。体外的端粒DNA也有相互粘附的现象。Lipps发现提纯的尖毛虫大核DNA相互并合成大的多聚体。并认为是由于端粒DNA间相互并合所造成的(H．J．Lippz，1980)。Y．oka又对这一现象进行了研究，他们发现这种粘附现象明显不同于互补单链间的配对。这种端粒与端粒间的相互作用意义还不十分清楚，人们认为它一定影响着染色体的行为，如基因重组以及基因表达。这一方面还需要进一步的研究。端粒的长度与序列变化常常伴随着一些有趣的生物现象发生。余国良等(1990年)用显微注射的方法将天然的以及人工突变的端粒酶RNA基因导入四膜虫。结果发现，注射天然野生型基因的四膜虫与未注射的对照组没有差异。而注入突变基因的四膜虫变得形态异常巨大、形状不规则并且老化。大多数后代都死掉。检查其端粒DNA，发现已掺入突变序列，且长度要么比平均长得多，要么短得多，表现为端粒长度调节机制紊乱或端粒延长统缺陷。酵母estl株是一种不能有效进行线性染色体复制的突变株，它的端粒长度随着细胞分裂而缩短。同时它的活力、集落形成能力也不断下降而最终出现老化(V．Lunddiad和J．W．Szoxtak，1989)C．B．Harley等1989年用人的端粒重复片段(TTAGGG)2为探针对胎儿的细胞株，新生儿细胞株以及青年和老年的细胞株的端粒长度进行了研究，发现随着年龄的增长，人的成纤维细胞的端粒序列长度不断下降。端粒DNA和着丝粒DNA一样是一种结构DNA。端粒结构不仅仅是为染色体的完全复制所必需，而且端粒的变化可以引起细胞形态乃至于生命状态的变花。端粒在参与细胞功能的同时，还参与着细胞结构的构建。20世纪初，许多细胞学家就发现动、植物细胞中期，间期染色体有不随机分布性。他们常常看到端粒位于核膜附近，总是位于与着丝粒相对的位置，并把这一现象称为“Rabl定向”(E．B．Wioson，1924)Fussell用H－T对洋葱根尖细胞进行脉冲标记，发现无论是G1期、S期、G2期还是早前期，其染色体的走向都和分裂末期的染色体一样，着丝粒异染质聚集于核的一边。而端粒则位于着丝粒的对侧。成散在状分布，端粒和着丝粒均与核膜逼近，并认为可能正是这种与核膜的紧密结合关系。维持着细胞染色体的空间定向，使得染色体所携带的信息能有秩序而又有效地复制表达。1984年D．Shoeman用光镜摄像系统对果蝇唾腺的多线染色体进行断层分析，计算机重建了唾腺染色体的三维空间模型，也发现染色体的顶端常位于核膜下。R．T．Shoeman等1988年在体外进行了中间纤维蛋白Vimentin和Lanins与不同寡核苷酸序列之间的吸附实验。发现端粒序列与中间纤维单克隆抗体进行免疫印迹，发现55kD和68kD条带处有阳性反应。因而他推断端粒蛋白与中间纤维以及Lamin有关。可能它们共同组成大核的核骨架系统。汪国顺等1992年用HeLa细胞为材料，用选择性抽提方法，分离出核骨架，并从而得到与核骨架紧密结合的DNA。然后用人的端粒序列为探针与之杂交，结果表明端粒富积在核骨架上，因而从一方面证明了染色体端粒与核骨架的结合关系。端粒的研究已经从研究其DNA序列及其与染色体复制关系发展到对其多方面生物学功能的研究。目前人们尤为感兴趣的是它与核内骨架(包括核纤层)以及染色体空间定位的关系，端粒酶做为反转录酶的一种特殊类型(酶自身含有其作用底物模板)所具有的生物学特性等。(北京大学生物系汪国顺、潘惟钧、翟中和院士撰) |