【柑桔原生质培养与育种】
拼译：protoplast manipulation and breeding in citrus
胚性愈伤组织的诱导 胚性愈伤是进行柑桔原生质体培养和融合的最佳起始材料。迄今还没有一例关于胚性愈伤组织(或悬浮细胞系)之外的原生质体培养再生的报道。柑桔胚性愈伤组织一般是由开花后2－8周的珠心组织诱导产生，吴金虎等在MT基本培养基上(Murashige，Tucker，1969)附加IAA0．1～0．5mg／l，KT0．5～1．0mg／l，接种花后7周的珠心组织，诱导出4个柑桔品种的胚性愈伤组织。同时发现不同品种产生愈伤组织的能力与该品种每种子含珠心胚的数目存在一定联系。在试验的4个品种中，每粒种子胚数从多到少的顺序为椪柑、锦橙、桃叶橙和本地早。它们产生胚性愈伤组织的百分比分别为48．5%、21．2%、19．8%和2．2%。对于一些单胚性种或品种，以及个别的多胚性种，较难获得胚性愈伤组织。如枳(Poncirus trifoliata Raf．)、柚子(Citrus grandis Swingle)一直未能得到胚性愈伤组织。获得胚性愈伤组织的另一条途径是从败育的种子中诱导。甘霖等通过这一途径获得了几个柑桔品种的胚性愈伤组织。邓秀新等(1988)较系统地研究了山金柑(Fortunella hindsii Swingle)试管实生苗下胚轴及根部直接产生胚性愈伤组织的现象。成熟的山金柑种子播种在MT基本培养基中，50d后，有16．7%的幼苗从子叶下0．1～2．0cm处产生这类愈伤组织。甚至将子叶下0．5cm处的一段组织培养在MT基本培养基上，38．5%的外植体产生了胚性愈伤组织。这一简易获得胚性愈伤组织的途径在金柑属的其它种以及柑桔属的一些种均得到证实，只是品种(种)不同，产生的频率有差异。个别品种，如‘脐橙’败育胚珠容易诱导胚状体，而不易获得能继代的胚性愈伤组织。叶新荣等(1991)在培养基中加入AgNO35mg／l，以抑制乙烯产生，获得了该品种的胚性愈伤组织。通过以上各类途径获得的柑桔类愈伤组织在无外源激素的MT培养基中均能继代保存，并保持较好的胚胎发生能力。如今，实验室一共有近20个柑桔种(品种)的胚性愈伤组织，为以柑桔愈伤组织进行的各类研究提供了方便。不同品种(种)的胚性愈伤组织，它们的胚胎发生能力有较大差异。一个品种的愈伤组织的干物质含量，可溶性蛋白质含量以及脱氢酶活性均与其胚胎发生能力呈正相关。柑桔的胚性愈伤组织干物质含量如果低于10．0%，则再生能力很弱。一般的柑桔胚性愈伤组织干物质含量在10．0%以上。对胚性愈伤组织胚胎发生的控制一直是研究的热点。以甘油取代培养基中的蔗糖促进了愈伤组织向胚状体方向进展。进一步的研究发现，虽然1%～5%甘油取代蔗糖后，促进了胚状体的再生，但对胚状体后期的发育并不有利。由此产生的胚状体在添加麦芽浸出物1500mg／l或硫酸腺嘌呤5mg／l的MT培养基中可进一步发育，减少畸形胚状体比例。 原生质培养再生植株 柑桔原生质体培养技术首先由Vardi等(1975)报道。邓秀新等(1988)以我国离栽甜橙(Citrus siinensis Osbeck)品种锦橙胚性愈伤组织为起始材料。采用0．3%的果胶酶和0．3%的纤维素酶离析愈伤组织，获得原生质体。原生质体经浅层培养方式，在无外源激素的MT基本培养基中，7d时有44%的细胞恢复分裂。采用低熔点琼脂糖包埋(半固化)可使恢复分裂的原生质体比例进一步提高到50%。经双层培养．扩大培养面，细胞团可以再生出胚状体。如转入摇床悬浮培养因改善了培养条件，胚状体再生整齐一致。而且，原生质再生成株的时间比固体培养缩短了1～2个月。再生植株移栽过程中，适当降低温度至25℃，能有效地减少试管苗的萎蔫，使移栽成活率达到90%以上。邓占鳖等(1993)利用已建立起的柑桔原生质体再生体素，从锦橙，桃叶橙耐盐突变系分离原生质体，经培养再生成植株。耐盐系原生质体在盐胁迫下，存活率和生长都正常，说明耐盐系是稳定的，耐盐系积累较多的脯氨酸，持较高水平的K+，而吸收较少的Cl－和Na+。邓秀新等在建立再生体系时，已获得9个种(品种)的原生质体再生植株(表1)。目前，正在利用这一体系进行抗寒突变体筛选，以及进行自然嵌合体分离纯合研究。表1
原生质体融合与体细胞杂种再生1．已获得的体细胞杂种。Ohgawara及Grosser等应用原生质体融合技术分别获得了柑桔属间体细胞杂种。这一技术不仅克服了性器官败育造成的杂交障碍，而且，实现了柑桔(Citrus)与有性不亲和的近缘植物的基因重组，创造出前所未有的属间杂种，这些工作都展示了这一技术在未来育种中的巨大潜力。邓秀新等(1992～1993)采用聚乙二醇(PEG)诱导融合方法，将一个亲本的悬浮细胞系或胚性愈伤组织的原生质体与另一个亲本的叶肉原生质体融合，经浅层－双层－固体培养体系再生成植株。(表2)首次实现柑桔类植物果实经济价值最大的二属间的融合。这一技术的建立达到了预期的第二个目标，即能使不同柑桔种(品种)间有效地实现基因重组。该融合技术体系利用叶肉一方在所用的培养条件下无法再生这一特点作为选择条件。所以再生植株中有几种类型，即体细胞杂种，胚性亲本以及胚性亲本自发融合的类型。再生植株必须经过遗传鉴定方可确定，如采用叶片形态，染色体数目以及多种同工酶。同工酶分析，经济方便，绝大多数同工酶表现十分稳定，已广泛应用于体细胞杂种的鉴别中。表2
2．体细胞杂种再生。(1)基因型的影响。基因型对融合体再生能力有明显的影响。对目前世界上共获得的60多个柑桔种间及属间体细胞杂种的亲本组成分析，发现有55%的组合含有甜橙(C．sinensis)这个种。在同一条件下进行不同基因型对融合体再生的影响试验表明，不管是作为叶肉原生质体亲本，还是作为胚性愈伤组织(悬浮系)原生质体。再生容易的种(品种)从现在的一些遗传研究结果来看，均是杂种起源。起源上越近的种类，其再生能力越强，而一些古老的品种，如红桔则再生困难。这一结果在柑桔的器官培养中同样也观察到。(2)再生过程中的染色体变异。对融合体再生过程中的染色体数目进行观察发现，一些再生十分困难的组合，如脐橙与红桔，胚状体中有近20%为非整倍体，还观察到个别融合体细胞分裂不同步现象，认为再生困难主要与此有关。邓秀新等(1993)在粗柠檬与甜橙的融合再生植株中观察到叶肉亲本类型，同工酶检测表明它含有另一亲本的个别带、而染色体数为二倍体2n=2x=18。这些事实说明柑桔远缘的属间，甚至个别亲缘关系很近的种间融合，在一定程度上存在或多或少的不协调，至少植株再生以前是这样。对已获得的一批体细胞杂种的植株形态，生长情况连续几年的观察表明，体细胞杂种性状稳定。体细胞杂种均为异源四倍体2n=4x=36，同工酶为双亲酶带的合。这一系列的结果说明，再生过程，特别是融合体的胚胎发生过程就像一个筛网一样，将一些不利于生命本身的变异滤掉，显示出生物的保守性。(3)植株再生过程中的困难。相对未融合的细胞而言，融合体再生较难一些，主要表现在融合后再生的畸形胚状体的比例较高。这些胚状体无法直接萌发，而必须经过器官发生途径，即先诱导不定芽，然后，再生根成为完整植株。个别含有野生种的组合，如伏令夏橙与宜昌橙种间融合，再生的不定芽在所试验的条件下均不生根；邓秀新等(1993)采用试管微嫁接方法，终于获得该组合的一批体细胞杂种植株。3．体细胞杂种的竞争优势。在所进行的一些融合组合中，如伏令夏甜橙与宁波金柑属间，哈姆林甜橙与粗柠檬种间等，体细胞杂种再生的频率很高，达67%。在一个半选择培养条件下，异源四倍体体细胞杂种在与二倍体的竞争过程中，表现出一定优势。不少组合，再生的第一株植株是体细胞杂种也说明了这一点。4．再生植株中出现叶肉类型植株。目前还没有报道过柑桔叶肉原生质体能单独培养再生。但是在个别融合组合中发现了叶肉类型植株。这一类植株是因为融合的作用，还是因为另一方的饲喂作用得到再生。或者是融合体丢失了另一方的部分(或全部)染色体后再生的，还有待进一步研究。粗柠檬、酸橙叶肉原生质体单独培养，曾观察到1～2次分裂，但后来停止生长。5．体细胞杂种的农艺性状与育性。(1)生长特性及抗性。所获得的几个体细胞杂种，有3个已移入大田。体细胞杂种植株，表现出四倍体的一些特点，如叶片较二倍体厚，刺较长、较粗，枝条粗壮。同一组合再生出的体细胞杂种之间，叶片和枝梢生长习性未发现有明显的变异。采用电导法和膜脂肪酸组份分析法对3个体细胞杂种的抗寒性进行测定，结果显示，柑桔体细胞杂种的抗寒性介于双亲之间。如金柑与甜橙的体细胞杂种可耐－9．5℃，而其亲本分别耐－10．0℃和－7．8℃。1993年11月底骤然降温，植株未完全进入耐寒状态，粗柠檬叶片受冻，78．5%的叶片脱落，而它与抗寒性较强一点的甜橙的体细胞杂种落叶率为48．9%，同条件下的甜橙为30．4%。同一园内，金柑以及金柑与甜橙的体细胞杂种无落叶，这一结果说明原生质体融合途径在培育抗寒柑桔类型中具有潜在价值。(2)体细胞杂种的育性。迄今，已有几例柑桔体细胞杂种开花结果的报道。墨西哥来檬与伏令夏甜橙种间体细胞杂种表现出可育，几年的测定表明，其花粉育性稳定，达到38%～52%，平均每果有6粒左右的种子，含酸量较高，果汁较多，果皮中等厚。枳与甜橙的属间体细胞杂种花粉育性达到90%，接近高值亲本枳(91%)。体细胞杂种植株花粉粒比亲本大，体积为双亲花粉体积之和。这类异源四倍体植株，由于染色体的互补作用，使原来亲本的一些不正常现象消失了，如染色体易位突变体‘伏令夏’甜橙与染色体到位突变体‘墨西哥’来檬融合之后，由于相互弥补对方的染色体缺限，杂种植株表现出种子增多。粗柠檬与甜橙的杂种也表现出花粉可育，但是，也表现出与粗柠檬相同的特性，即部分花为雌蕊败育花。问题与展望1．体细胞杂种的倍性问题及解决方法。采用目前的对称融合技术，获得的(至少绝大多数)是一个对称杂种。人们在希望获提2个优良性状重组的同时，并没有方法阻止不良性状的进入。正因为如此，在过去的20年中，植株体细胞对称融合技术未能有效地应用于育种实践。目前柑桔栽培的品种以二倍体为主，其次是三倍体，体细胞融合虽然有效地克服了有性杂交中遇到的珠心胚干扰问题，可获得杂种。但是，得到的是一个四倍体，作为接穗品种应用可能会有局限性，针对这一问题已经或将采取下列措施。(1)作为砧木应用。柑桔同许多其它果树一样，生产中应用的个体是由地上(接穗)和地下(砧木)两部分构成的一个复合体。人们往往通过采用理想的砧木来提高地上部分的抗病虫及抗逆境能力，而对砧木本身的果实品质、产量考虑很少。因此，体细胞杂种作为砧木应用将会有很大的潜力。(2)体配融合一步获得三倍体无核柑桔类型。邓秀新等(1990)从柑桔的四分体小孢子中分离出单倍体原生质体。将柚子的四分体单倍体原生质体与甜橙二倍体原生质体融合，已再生出三倍体胚状体。并在这种体配融合后的原生质体培养过程中，首次观察到花粉管生长和分裂现象；这一现象说明控制花粉管生长的基因在四分体时期已转录或者表达。目前，已开展多个组合的体配融合研究，其中甜橙与枳的体配融合已再生出植株，待进一步作遗传鉴定。这一技术的建立将解决体一体融合的四倍体化问题，获得三倍体柑桔类型。三倍体柑桔果大、无籽，是柑桔育种者一直追求的目标之一。(3)不对称融合转移部分基因。Vardi等则采用了不对称融合体系，即将一方的原生质体用射线处理，使其核失活；而另一方，采用代谢抑制剂碘乙酸处理，使胞质失活，然后再融合，获得了一批胞质杂种，染色体倍性不增加而又达到了转移一些基因的目的。(4)作为一座桥梁，使存在于野生种的一些有利基因向栽培品种转移。从某种意义上讲，目前已建立起的融合技术类似一座“桥梁”，它使一些不亲和，有性杂交有障碍的两种(属)间能实现基因重组。花粉育性测定结果显示，柑桔体细胞杂种是可育的，可作为杂交亲本利用。2．展望。植物原生质技术首先在烟草上获得成功。经过20年的发展，正如许多人预料的那样，首先应用的将是在能无性繁殖的木本植物中。果树大多属于这一范畴的植物。细胞融合获得的优良个体，只要农艺性状优良，就可通过无性方法繁殖成为无性系品种获得“一劳永逸”的作用。而一些大田作物往往会因不育而不能保存，应用生产则更困难。从这一点讲，一些林木应用这一技术将具有更大的潜力。【参考文献】：1 甘霖，章文才，邓秀新．从败育种子诱导柑桔的胚性愈伤组织．华中农业大学学报．1993，12(5)：490～4922 邓占鳖，章文才，万蜀渊．诱发柑桔珠心愈伤组织及其原生质体细胞胚胎发生与植株再生．实验生物学报．1990，23(2)：135～1433 邓占鳖，章文才，万蜀渊．柑桔耐盐系的离体诱发与原生质体植株再生．园艺学报．1993，20(2)：127～1324 邓秀新，邓占鳖，章文才．锦橙、山金柑胚性愈伤组织诱导及原生质体再生成株．农学通报．1989，(3)：13～155 邓秀新，章文才．柑桔染色体倍性操纵与育种．果树科学．1993，10(增刊)：23～286 邓秀新，F G Gmitter，J W Grosser．柑桔同源及异源四倍体花粉育性研究．园艺学报．1995，22(4)7 吴金虎，陈吉笙，章文才，等．柑桔胚珠培养及胚状体发生的研究．果树科学．1990，7(1)：19～248 Deng Z A，Deng X X，Zhang W C，et al．A preliminary report on gametosmatic fusion in citrus，Proc．Inter．Soc．Citriculture 1994，1：170～1729 Murashige T，Tucker D P H．Growth factor requirements of citrus tissue culture．Proc lst Int．Citrus Congress．1969，3：1155～116110 Ohgawara T，Kobayashi S，Ohgawara E，et al．Somatic hybrid plants obtained by protoplast fusion between Citrus sinensis and Poncirus trifoliata．Theor．Appl．Genet．1985，71：1～411 Soost R K，J W Cameron．Citrus，In：J．Janick and J．N Moore(eds)．Advance in Fruit Breeding．Purdue Uni．Press，West Lafayette，Indiania，1975．507～54012 Vardi A，Breiman A，Galun E．Citrus cybrids：Production by donor-recipient protoplast-fusion and verification by mitochondrial DNA restriction profiles．Theor．Appl．Genet．1987，75：51～58(华中农业大学邓秀新撰) |