| 释义 |
【单克隆抗体与杂交瘤技术】
拼译：monoclonal antiboby and hybridona technology
1975年，克勒(G．Koehler)和米尔斯坦(C．Milstein)报道了用细胞杂交技术将小鼠骨髓瘤细胞与预先用抗原免疫的小鼠脾细胞(淋巴细胞)进行融合，可产生能分泌预定的、单一特异性的抗体(单克隆抗体，简称单抗)的杂交瘤细胞。此后，此项技术在生物学、医学的各个领域得到应用，并为抗体产生和免疫球蛋白(Ig)遗传控制及基因工程制造人单抗的研究提供有力的手段。 1890年，贝林(E．A．Von Behring)首先发现免疫动物血清中存在能特异性中和白喉毒素的抗体。其后人们试图制造纯一的抗体和分析机体对某种免疫原的抗体反应。杂交瘤细胞由于继承了双亲的特点，既保存了骨髓细胞能在组织培养中无限迅速增殖的特性，又继承了亲代B细胞能产生特异性抗体的特性。这一技术的优点为：(1)特异性高。(2)供应量无限。(3)可用不纯抗原进行免疫获得纯抗体。(4)只要该抗原能在动物(如小鼠)中引起免疫反应，就有可能获得(拯救)所有特异性的抗体。(5)提高特异性B细胞的比例10～100倍。(6)B杂交瘤能产生高分泌量的抗体，且与原B细胞是否高产无关。(7)抗体可以人工操纵、改造，如可将两种特异性的杂交瘤再次融合产生能分泌双特异性抗体的杂交瘤。(8)此原理已成功地应用到T细胞杂交瘤技术，以拯救T细胞的功能。下表简要说明单抗应用实例。表1 单抗应用实例 
有关杂交瘤技术 (1)免疫方法：许多不同的免疫方法和程序均有成功的报告，值得一提的是1984年施皮茨(m．spitz)的脾内免疫法，如果采用不开腹手术注射法更便于推广。此外，体外免疫法不仅对制造小鼠单抗有用，而更适合于制造人单抗。人B细胞体外免疫加氨基酸酯效果更为显著。这可能是产生分泌人单抗杂交瘤的成功关键。(2)提高融合率：如1984年罗(M．M．S．Lo)等及1985年卡斯腾(U．Karsten)等采用电融合法提高融合效应。1986年以来，史良如等在融合前将骨髓瘤细胞注射于小鼠皮下使之产生实体瘤，然后分离出瘤细胞进行融合的“活体瘤”法，可提高融合的成功率。1983年，西拉刚尼安(R．P．siranganian)等将加强免疫后的B细胞在融合前先注射到经放射处理的小鼠中，使特异性B细胞率放大，产生特异性单抗的杂交瘤率提高50倍。也有用“抗原－聚焦”融合法的，即将抗原共价结合到骨髓瘤细胞上再进行融合，以提高特异性杂交瘤产生率。(3)改进筛选方法：迅速、正确地筛选出所需杂交瘤并及时克隆化，是杂交瘤技术成功的又一关键，其方法可按要求而异，如只需高滴度的和高亲和力的抗体，则可将杂交瘤上清液先稀释10～100倍，然后进行筛选，以很快去掉低产者；如只需某些类、亚类的单抗，则可应用特异性抗该Ig类、亚类的标记二抗来选择。此外，荧光活化细胞分类仪(FACS)的应用，大大加速了抗细胞表面单抗的筛选和分析。单抗的大量生产技术 虽然鼠类腹腔培养杂交瘤细胞的体内法不适合工业化生产，且腹水抗体用于治疗有很多缺点，因此极需发展单抗的体外培养法。生物反应器、旋转滚动瓶培养系统、全程序控制的旋转瓶系统、微囊法、中孔纤维器及发酵罐培养法竞相发展。微囊法是将杂交瘤细胞包于直径为0．5～3mm的矽藻土的囊中(囊的外壁有半透膜)进行培养，以生产纯抗体，这是很好的主意，可惜有的杂交瘤不易成功。中孔纤维培养系统模拟体内毛细血管原理，将几百根很细的中孔纤维排列在圆柱体中，细胞在含有半透膜性质的中孔纤维间隙生长，其密度可达10×108／ml，是较有希望的方法。美国Bioresponse公司的牛淋巴液体外循环生产单抗法也是以此为基础。目前，大规模生产单抗最成功的还是发酵罐培养法。英国Celltech公司1988年投产的气升法发酵罐，年产量可达15kg单抗Ig。当然、大规模生产单抗有赖于细胞培养液，特别是低血清和无血清培养液的发展。免疫毒素 它是细胞结合性抗体和毒素(细菌毒素，为假单胞菌外毒素A及白喉毒素等；植物毒素，如蓖麻毒A链)的耦联物，在某些肿瘤的治疗上获得令人鼓舞的结果，理论上也适用于传染病(如HIV感染)、真菌病和寄生虫感染及自身免疫病的治疗。特别是用于自身骨髓移植时清除恶性B细胞及同种异体骨髓移植时去除供者骨髓中的T细胞可减少移植物抗宿主病(GVHD)，但对某些肿瘤，如乳腺癌、结肠癌等不那么理想。人单抗的研究 人单抗一直令人感兴趣，其原因是：(1)对某些抗原(RhD HLA)，鼠类不能识别或反应很差。(2)鼠类单抗作为肿瘤造影、肿瘤或自身免疫病等治疗及被动免疫时，在人体内可引起免疫反应，清除单抗的作用和引起受体的副反应。人单抗体内应用可大大减轻此弊病，而且更适合于人效应细胞。此外，人单抗的研究可获得有别于鼠类抗体库的知识。1977年，舒泰尼茨(M．Sretnitz)第一个成功地获得产生人单抗的永久化细胞系，但以后的进展缓慢。关键是应用常规的小鼠杂交瘤技术制造人单抗难以成功。因为用来融合的人淋巴细胞多来自外周血淋巴细胞(PBL)，其活化的淋巴母细胞比例太低；人免疫方法受限制；缺乏合适的人融合伙伴；应用人骨髓瘤细胞系进行融合成功者不多，只有两组报道，如1980年奥尔桑(L．Olsson)和卡普兰(H．S．Kaplan)融合U－266ARl和人脾细胞(以前免疫过的供者)获得抗DNP中抗原的IgG抗体。最早采用且现仍应用的E．B(Epstein－Barr)病毒转化技术可使B细胞活化、分裂，以制造分泌抗细菌、病毒、血细胞(第1个人单抗，即舒泰尼茨报告的抗RhD单抗，即用此法制备)、肿瘤细胞和自身抗原的抗体。但转化的B细胞比例和抗体产量低，且细胞系不稳定。近年来，也有不少人采用人淋巴样细胞系(LCL)作为融合伙伴，如GM 1500及由此派生的KR4、KR12；WI－L2－729－HF2和1991年兰加帕(N．Rangappa)等从此系又衍化出的HOA－1、HOA－20。不少学者也试图用小鼠骨髓细胞作为融合伙伴，产生异种杂交瘤，但人染色体2(含K链基因)常优先丢失。因此，有人又设想先将人的和小鼠的骨髓瘤细胞融合成为异种骨髓瘤细胞系，选择出合适的融合伙伴，但至今人单抗技术仍不成熟，寻找合适的融合伙伴是当务之急。鼠单抗改造与人化单抗 1992年戴欧(M．J．S．Dyer)综述：(1)嵌合型抗体：可用蛋白工程法，即应用化学法将鼠类单抗的VH／VL及CH1和CL(Fab)连接到人CH2／CH3片段(Fc)上产生保持有鼠类单抗的结构，但有人抗体的效应功能。用遗传工程法，即克隆的鼠类VH－VL的DNA片段(抗原－结合区，即互补的决定簇区，CDRs和骨架区残基，FRs)可插入到有人C区基因的质粒上，然后转染到骨髓瘤细胞中产生抗体。(2)遗传学上改变了的人单抗，又称人化抗体。1988年，里希曼(L，Riechman)等创立了这种技术，它不是移植整个V区，而正好是将编码6个高可变环的DNA(即CDRs)引导到人高可变环的DNA顺序中，它们很像原鼠类单抗的DNA顺序，但抗原性更接近于人。CAMPATH－1(一种抗淋巴细胞单抗)已按此法进行改造，这种“人化技术”已成功地应用于其它单抗的改进，如抗Tac－H。进一步，应用基因工程方法来制造人单抗。当然，这些成功很大程度上来自于人们已发现许多VH等功能区(domain)单独也能结合抗原的启发。单键抗体对治疗体内造影药物过量中毒有其独特的优点。最初的抗体基因来自杂交瘤，然后克隆并完整表达在哺乳类动物细胞上。1988年姜(Y．L．Chiang)及1989年奥兰(R．Orlang)报告的将抗体基因直接从免疫动物的淋巴细胞克隆表达在细菌上，然后通过筛选与抗原结合的抗体的方法有可能越过杂交瘤技术。进一步，1990年麦克卡弗蒂(J．McCafferty)等证明在丝状噬菌体表面表达抗体片段的可能性，且能正确折叠和结合抗原，这一发现打开抗体制备的新路子。抗体基因库可用PCR法放大，并克隆到噬菌体中。这样便产生大量的噬菌体库，每个都显示一种抗原结合特异性(估计可达106～109个)。进一步，马克斯(J．D．Marks)等1991年已证明，应用噬菌体表达技术已能用未经免疫的供体的噬菌体抗体(phage抗体)库(来自人PBL中IgG和IgM的mRNA)分离出特异性抗原的人抗体。这说明有可能用这些库分离直接抗“自身”的或其它非免疫抗原的人抗体而不需要动物。杂交瘤技术已证明是有用的，成千上万个广泛范围的单抗已被制备出来，并应用于研究和人类的健康管理。但制备单抗费时，而且此法主要适用小鼠，制备大鼠的单抗虽也较成功，但制备人单抗至今仍未过关。基因工程发展至今日，已能从正常的未免疫动物克隆抗体基因并在噬菌体中表达分离特异性的抗体片段，这是令人鼓舞的。这种库克隆技术或噬菌体抗体能否作为克勒－米尔斯坦杂交瘤技术的补充还是代替物?是否这就是长期以来人们向往的获得人单抗的普通途径?真的不要免疫动物就能制造人单抗?简单回答这些问题还为时过早。【参考文献】：1 Koehler G. Milstein C. Nature, 1975,256:4952 Milstein C. Science,1986,231:12613 Koehler G. Science,1986,233:12814 James J. Scand J Immunol. 1989,29:2575 Spooner R A,Lord J M. Tibtech. 1990,8:1896 Winter G,Milstein C. Nature, 1991,349:2937 Dyer M J S. Eur J Cancer, 1992,28:2768 Chiswell D J,McCafferty J. Tibtech, 1992,10:80(武汉生物所博士生导师史良如撰) |