【马铃薯原生质体培养技术】
拼译：techiques of potato protoolast culture
原生质体培养是进行植物遗传操作(如体细胞融合和杂交、基因或细胞器的转移等)的基础，同时也是获得体细胞变异的一个重要来源。自从1960年柯克因(E．C．Cocking)首次报导由烟草叶片分离原生质体的技术以来，原生质体培养的技术经过不断改进，已在许多植物中获得成功，并已在生物技术的许多研究中得到广泛的应用。
马铃薯是继烟草之后研究取得成效较大的一种植物。最早关于马铃薯原生质体培养的报道是1973年洛伦则尼(M．Lorenzini)和1975年乌帕亚(M．D．Upadhya)，他们分别用块茎和叶肉细胞分离出原生质体，但未得到分化苗。1977年，布滕柯(R．G．Butenko)等用普通栽培种叶肉原生质体获得了分化苗，但具有不正常的染色体数。与此同时，美国的谢巴尔德(J．F．Shepard)等报道，从一个大面积栽培品种“赤褐布尔班克”的叶肉原生质体得到了生长正常的再生植株。1978年，秉汀(H．Binding)等用不同的培养基的培养方法，从普通栽培种的一些双单倍体无性系的组织培养苗叶片游离出原生质体，并得到了分化苗。进入80年代后，有不少关于对马铃薯原生质体培养方法的研究报道。在国内，则只有1988年李耿光等和1989年李世君等的两篇报道。游离原生质体供体材料的选择十分重要。在早期，马铃薯的原生质体培养都是用温室生长的幼嫩叶片进行游离叶肉细胞原生质体的。这种材料虽然取材容易，但污染严重，不容易得到无菌的或无病毒感染的组织，使原生质体培养的成功率受到很大影响。80年代初开始，人们普遍采用组织培养的试管苗作为供体材料。这种方法虽然能排除材料被污染的问题，但进行一次试验要培养大量的试管苗，每一瓶试管苗只能摘取少量幼嫩的顶尖，下部的叶片看起来比较嫩，但实际的年龄已老，游离出原生质体后不容易获得有分裂能力的细胞，影响了试验的效率，且费工费时。近年来，有一些研究者采用其他供体材料，成功地游离出原生质体并得到了分化植株。但是，实践证明，这些组织和细胞中存在着大量染色体数目变化的细胞，由它们的原生质体分化的苗有许多生长不正常，不如叶肉细胞原生质体好。1987年，戴朝曦等曾报道用马铃薯实生苗刚出芽不久的子叶及下胚轴作为游离原生质体，取得了良好的结果。实践证明，子叶和下胚轴具有以下优点：(1)取材容易，无需花费大量劳动去培养试管苗；(2)容易消毒，易于获得大量的无菌组织，并且绝大多数马铃薯病毒都不能通过实生种子传播，实生苗基本上是无毒的；(3)子叶和下胚轴是由种子刚长出的幼嫩组织，有很强的细胞分裂和再生植株的能力，而且可以获得大量在发育阶段上同步的细胞，因而可以大大提高原生质体的植板效率和再生植株的频率；(4)由子叶及下胚轴原生质体再生的植株倍性稳定，生长都很正常。用子叶和下胚轴游离原生质体，目前存在的一个重要问题是因为现有的实生种子都是遗传上的杂合体，所得到的原生质体植株之间性状上的差异较大，如果用它来进行遗传操作或体细胞融合，不容易获得定向的结果。但是，如果培养原生质体的目的在于获得变异植株，则它比用其他组织材料更具有优越性，并且，当今后不分离的杂种实生种子选育出来以后，这个缺点也会随之消失。游离和纯化原生质体的方法，可以归纳为漂浮法和沉淀加漂浮法。前者以谢巴尔德的研究为代表，后者以秉汀的研究为代表。漂浮法是从酶解液开始到每次洗涤都用分子量和浮力较大的蔗糖作为渗压的调节剂和漂浮剂。此法的优点是药品价格低，原生质体从游离出来直到洗涤的每次操作都漂浮在容器的顶部，可避免因组织碎片的撞击和离心时的挤压而引起的破裂损失。为了使漂浮的原生质体尽可能被收集起来，减少浪费并尽可能干净地除去酶液，谢巴尔德等采用了一种分析牛奶用的细颈离心瓶作为分离和清洗原生质体的工具。但是，这种瓶子体积较大，每次要用100ml左右的酶液或清洗液，还要用一个特制的大离心机进行操作，既浪费药品，又容易造成污染。戴朝曦曾将此瓶进行改良，设计了一种能在普通离心机上使用的
～10ml的细颈瓶，每次用6ml左右的酶解液和清洗液，获得了良好的结果。沉淀法是在酶液中加入分子量和浮力较小的甘露醇，而不加蔗糖，原生质体游离出来后沉入底部，清洗时用普通离心管操作，最后将沉淀物用高分子量的Percoll(一种用胶状PVP包裹的二氧化硅液体)或聚蔗糖漂浮原生质体，操作比较简单，但由于在游离和清洗原生质体过程中原生质体都处于容器的底部，容易被挤破，造成损失，而且所用的漂浮剂价格昂贵，不能广泛采用。此外，在最后一步漂浮时，也有人采用将20%蔗糖注入试管底部，离心后从蔗糖垫与原生质体悬浮液界面上收集原生质体的方法，但是，这种方法仍然存在着原生质体收集不净的问题。关于马铃薯原生质体培养所采用的培养基，尽管许多关于原生质体的报道都涉及到这个问题，但大多是按谢巴尔德或高国楠(K．N．Kao)等的培养基经适当修改而成。所有培养基的共同特点是只含有少量的铵离子；因为铵离子浓度高时对马铃薯原生质体会产生毒害作用。此外，绝大多数原生质体分化培养基都采用价格较贵的玉米素作为细胞分化的激素。根据戴朝曦的试验，用6－苄基腺嘌呤代替玉米素同样可以得到很高的分化结果，并且发现原生质体从分裂到形成愈伤组织阶段对培养基的要求与基因型的关系并不密切，但在分化阶段不同基因型对培养基的反应差异很大，必须按其不同要求采用不同的分化培养基。在培养方法方面，谢巴尔德采用将琼脂糖包埋原生质体放到用普通琼脂配制的另外一种培养基上面的双层培养法。由于此法比较麻烦，在琼脂糖色埋、溶化等过程中，对原生质体的损失较大，所以，有许多研究者仍采用液体浅层培养法，待小愈伤组织形成后再转移到固体的或半固体的培养基表面。1983年，卡尔伯格(I．Carlberg)等报道，用一个“十”字形特制培养皿，隔板上有小口，在对称的两格中放置用琼脂糖包埋的原生质体，另两格放置有加1%活性炭的普通琼脂培养基，能显著提高原生质体形成愈伤组织的效率。在原生质体培养的密度方面，过去一般都采用1万～5万个细胞／ml的密度并认为过高或过低的密度对马铃薯原生质体的分裂和形成愈伤组织都有不利的影响。1991年，瓦拉(S．Warra)等报道，将来自普通栽培种双单倍体的原生质体先在5×103～1．0×105／ml的密度下进行液体浅层培养，3～4d后去掉培养基中的2，4－D，用培养基按1∶3的比例进行稀释。原生质体一直在25℃、红色暗淡光线连续照射下培养，14d后将小细胞丛转移到半固体培养基顶上，并转移到16h光照的强白色光下培养。用这种方法，他们可以使原生质体在2000～4000个细胞／ml的密度下高频率地得到愈伤组织和再生苗。1989年，亨特(G．J．Hunt)等报道，在修改的高国楠等的KM培养基上加入0．1%～2．0%的脱脂肪牛血清，用多孔培养板和半固体的琼脂糖包埋培养，在普通栽培种和野生种S．cardiophyllum中成功地实现了单个原生质体的培养，得到了单细胞分化的无性系，植板效率达37%～75%。关于马铃薯原生质体培养中再生植株发生变异的问题，1980年谢巴尔德报道，他们从“赤褐布尔班克”品种得到的1700个原生质体无性系中选出396个无性系进行田间观察，发现有许多无性系发生变异，在株型、熟性、块茎形态等方面与原始品种不同，特别是还发现了一些亲本所不具备的抗马铃薯早疫病和晚疫病的变异体，在实践中是很有利用价值的。以后，还有许多报道证实原生质体培养中产生的体细胞变异的问题，而且发现这些变异既包括染色体结构或数量上的改变，也包括基因突变。这些变异为育种提供了丰富的材料。但是，它同时也在利用原生质体进行体细胞融合或基因转移遗传操作中形成“背景杂音”，给操作结果带来不利影响。因此，今后对如何控制这些变异还需要进行深入研究。马铃薯原生质体培养技术虽然经过10多年的研究，已经取得了很大进展，但真正要使之能在实践中应用还需要进一步加以改进。今后研究的重点仍然是如何简化培养方法、提高培养效率以及如何控制在培养过程中发生的变异，特别是保持其倍性稳定等方面。【参考文献】：1 Shepard J F，R E Totten．Plant Physiol．1977，60：313～3162 Binding H，et al．Physiol Plant，1978，43：52～543 Thomas E．Plant Science Letter，1981，23：81～884 Carlberg I，et al．Plant Cell Reprots，1983，2：223～2255 Dai Chaoxi(戴朝曦)，D Mertz，V Lambeth．Plant Science．1987，50：79～846 Grun P，M W Wang，S Radke．Biotechnology in Agriculture and Forestry．，Vol 3 Potato Berlin，Spriner-Verleg，1987．195～2107 Jones H，A Karp，M G Jones．Plant Cell Reports．1989，8：307～3118 Hunt G J and J P Helgson．Plant Science，1989，60：251～2579 李耿光，张兰英．植物学报，1988，30(1)：21～2410 李世君，李向辉，孙勇如，生物工程学报，1989，5(1)：57～63(甘肃农业大学戴朝曦教授撰)