【生命科学与分析化学】
拼译：life science and analytical chemistry
生命科学是以生物的生命过程为研究对象，也是生物、化学、物理、数学等学科之间相互渗透形成的交叉科学，并将成为自然科学的带头学科。21世纪将是生命科学的世纪。
世界科技发达国家都将生命科学列为优先发展的领域。美国居领先地位。美国大学的化学家已经纷纷投入生命过程中化学的研究，形成了生物无机、生物分析、生物有机、生物高分子、生物物理化学等生命化学的新领域。生命科学和分析化学具有密切的关系。美国著名分析化学家B．L．Karger在1990年指出，生命科学中很多进展是分析化学所推动，如聚合酶链反应技术，多维核磁共振，DNA顺序分析、高分辨X－射线结构分析等新方法的发展，对生命科学进入分子水平的研究，带来巨大的影响。X－射线结构分析确定DNA分子的双螺旋结构，就为生命科学进入分子水平打开了一个突破口(L．Stryer)。基因DNA顺序分析为许多基因组、基因表达的调控和蛋白质结构、提供了大量信息是研究生命科学的分子基础；多维核磁共振波谱测定蛋白质分子的三维结构，已成为研究蛋白质结构与功能，探讨生物活性机理的基础；现代生命科学中很多问题已经成为化学和生物学的共同研究对象。生命科学向分析化学提出的热门课题，目前集中在核酸、蛋白质、多肽等生物大分子分析；生物药物分析，超痕量、超微量生物活性物质，如单个细胞内神经传递物质(多巴胺等)分析及活体分析；在生物无机分析中，痕量元素分析已集中到元素在生物组织层、单个细胞、甚至细胞膜中、人体蛋白质碎片内的微分布及其结合形式方面。使用超微量样品的微痕量分析，检出限要求达到fg(10－15g)级水平(高鸿，1991)。生物大分子的研究，涉及生命科学最本质的内容。一切生命活动都建立在生物大分子的结构、运动及其相互作用的基础上，其结构复杂，以蛋白质结构为例，分为4个层次，一级结构为氨基酸顺序；二级结构指互相接近的氨基酸残基的空间关系，多数是螺旋型结构；三级结构指相互较远的氨基酸残基的空间关系，通常提供生物大分子结构与功能之间关系；四级结构指各分子单元在复杂阵列中的装配，如含有几条多肽链(亚基)的蛋白质，亚基的排列具有更重要的生物功能。有关生物大分子一级结构的信息正在迅速增长。如已测定多种蛋白质的RNA(核糖核酸)全部顺序。基因DNA顺序分析已发表约3000万个碱基数据(A．E．Bruno，1991)。生命科学的研究已进入以生物工程为标志的新时期。生物工程可以分离基因和转移基因，根据人类的需要改造生物性，创造新品种，将成为21世纪的主导产业。人的基因DNA有30亿个碱基，目前已测量最长的基因序列是酵母DNA，全长约30万个碱基(K．B．Jacabson，1992)．它和人的基因DNA相比较，相差4个数量级。而且目前DNA序列分析速度，每年约100万碱基。DNA是由大量脱氧核糖核苷酸组成的极长的线形大分子，分子的骨架由糖和磷酸基团组成，在整个分子中不变。并含有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)4种碱基，其顺序是可变的。DNA是遗传分子，其遗传信息由碱基的顺序所决定。因此DNA顺序分析在人的基因及生命科学研究中占有十分重要的地位，也是难度较大的分析技术。DNA是很长的生物大分子，最小的多瘤病毒DNA分子由5100碱基组成。DNA顺序分析一般均先消化降解成若干片段。采用凝胶电泳分离，检测每个片段的碱基顺序，用计算机定出各片段的位置，再排出DNA的全部顺序。1977年提出了第一个实用的DNA顺序分析技术，采用化学裂解法或限制酶法消化降解DNA，以放射性同位素标记DNA片段。用凝胶板电泳分离，再用放射法检测。整个分析操作冗长、十分花费精力，一个5000碱基的DNA顺序分析，需两年才能完成。1986年提出用4种荧光染料标记DNA片段，采用激光荧光法测定，检出限达到1～100amolDNA／带。1987年美国Applied Biosystems公司推出平板凝胶电泳一激光荧光检测的DNA序列测定仪。在一块凝胶板上同时电泳24个样品，测序速度达到50碱基／(小时／每条泳道)或1200碱基／(小时／每块板)。由于采用激光扫描自动荧光检测，自动记录测定结果，并绘制出彩色图谱，排出DNA顺序，方法较简便、快速、无放射性危害和污染。1984年Schwartz等提出改进的脉冲场平板凝胶电泳(PFGE)，分离DNA碱基能力提高约2个数量级，适用于大DNA片段的分离，已用于例行分析。K．Gardiner(1991)对PFGF有详细评述。1992年Yeung等采用光学多道图像检测器(CCD)，在PFGF分离过程中，直接观察电泳分离图像，适时调节脉冲时间及条件，使电泳速度提高10倍，DNA测序能力据称达到23000碱基／h。1988年美国Karger等首次报道用毛细管凝胶电泳(CGE)分离DNA。经改善后，分辨率达3×106板／m，比HPLC分离提高近3个数量级。DNA测序速度达450碱基／h。荧光检测的检出限达100zmol。美国威斯康星大学L．M．Smith等(1991)在CGE分离DNA方面进行了一系列出色的研究。如在高电场(400V／cm)，CGE分离DNA序列速度高达1000碱基／h，比常规平板凝胶电泳仪测序速度快25倍。激光荧光检出限达到200zmol。加拿大Alberta大学Dovichi等采用He－Ne激光器及柱后激光荧光检测，检出限达2zmol(1200分子)。在高电场(365V／cm)DNA测序速度也达到1000碱基／h。单支毛细管电泳测序速度相当于24条平板电泳所得结果。1992年Europhor公司已推出自动毛细管电泳－激光荧光检测的DNA测序仪。目前已报道的DNA测序方法，应用于人的基因DNA30亿碱基序列的测定，仍远远不能满足要求，应提高分离通过量。Smith于1991年提出两条途径，采用很多毛细管同时平行进行电泳分离；或采用超薄凝胶平板电泳，提高分离速度。1992年X．H．Huang等报道毛细管阵列电泳装置，平行安排24支毛细管，同时进行电泳分离，采用激光扫描共焦荧光检测，获得较好分离效果，据称可以安排100支毛细管阵列电泳及同时检测，使分离样品数可增加2个数量级，有可能用于人的基因DNA序列测定。激光共振电离光谱具有检测单个原子的能力。已有应用于DNA测序的检测方法研究，由于具有很高灵敏度、很高选择性，高空间分辨率，很快的分析速度等优点，有可能在人的基因研究DNA测序中发挥作用。K．B．Jacobson(1992)DNA序列分析已应用于临床、约物、重组DNN生产医疗用蛋白质分析等方面。在法检科学中应用DNA测序侦破案，可能是法检分析的一个重大突破。每种蛋白质都具有专属的氨基酸顺序。测定蛋白质中氨基酸顺序是研究其生物活性的基础，氨基酸顺序的改变将产生异常功能和疾病，如镰刀形红细胞贫血病是由于一种蛋白质中一个氨基酸顺序的变化而产生。因此顺序测定是分子病理学的基础，是现代医学中前沿领域。由于同一祖先的蛋白质才具有相似的氨基酸顺序，因此在考古学中已发挥重要作用。蛋白质的氨基酸顺序分析，采用常规的液相色谱紫外吸收检测，但只能获得lpmol蛋白质序列信息。毛细管电泳－紫外吸收法的检出限改善到约0．2pmol。质谱法也可测定O、Xpmol蛋白质序列。1992年K．C．Dovich等提出毛细管电泳－光热检测法，使检出限改善3个数量级，达到0．5fmol(100fg)。并在13min30s内分离了20种氨基酸。二维分离是将两种不同分离原理的分离方法串联使用。它是提高分离效率的有效途径。Jorgenson等提出HPLC-HPCE串联技术分离蛋白质，鉴别了猪心和牛心的细胞色素C之间的差异，获得满意的三维谱图。核磁共振波谱是测定生物大分子结构的有力方法。A．M．Gronenborn等(1990年)对应用500～600兆超导核磁共振波谱测定溶液中蛋白质的三级结构作了详细的评论。质谱的新技术和新方法主要针对生物大分子分析，关键是扩大质谱范围及提高检测灵敏度。串联质谱(MSMS)、色谱联用(LC－MS)及软电离技术的研究十分活跃。大气压力离子喷雾法(API)(E．C．Huang等，1990)和电喷雾离子化法(ESI)(R．D．Smith等，1990)是LC－MS新的接口技术，适用于非极性到高极性及热不稳定生物大分子。如蛋白质DNA和多肽等，所得谱图有时还包括氨基酸序列信息。拉曼光谱中共振拉曼、傅里叶变换拉曼、共焦拉曼微光谱等在生物大分子结构分析中获得应用。可以获得DNA碱基组成、DNA和蛋白质二级结构、DNA与蛋白质比例等信息(G．J．Poppels等，1991)。神经传递物质多巴胺、儿茶酚胺类生物小分子分析，是生命科学前沿研究中最热门的课题之一，90年代生命科学已经深入到最复杂的领域、脑的结构和功能的研究。人脑有1011个神经细胞，通过神经原形成神经通路，成为脑的十分精确的功能基础。研究单个神经细胞中神经传递物质多巴胺等生物胺类如何产生信号、传导信号；以及这些信号如何改变靶细胞的功能，已成为探索人类的感知、学习、运动、思维和记忆等功能的物质基础。分析化学家的任务是研究和开发新的分析技术和新方法，提供脑神经细胞中神经传递物质及其代谢物浓度变化的信息。由于神经细胞的直径数十微米、体积仅数纳升，神经原传播信息速率高达50m／s，涉及在生物超微环境中检测快速化学反应，对分析化学提出了艰巨而诱人的挑战。单个神经细胞分析的难度在于常用的HPLC电化学，微型薄层色谱、GC－MS等方法，灵敏度不够；酶催化放射性标记法灵敏度高，但受反应活性的限制。美国宾州大学Ewing研究组于1987年首次提出用毛细管电泳(HPEC)－微电极伏安法分离及测定多巴胺及儿茶酚胺类神经传递物质。于1990年采用直径5μm毛细管电泳，直径2μm碳纤维电极直接插入毛细管柱的末端，进行电化学检测，毛细管柱的另一端作进样器直接插入池塘蜗牛脑神经细胞(直径200μm)中，首次对单个神经细胞中多巴胺及5－羟色胺进行了活体分析，样量仅0．27pl，检出限0．5amol。并对池塘蜗牛单个脑神经细胞中多巴胺的浓度变化进行了测量。由于哺乳类动物的脑神经细胞直径约20μm，必须进一步研究直径更小的微电极及尺寸更小的毛细管电泳，才可能对哺乳类动物的单个脑神经细胞进行活体分析。1992年，研制出直径400nm超微碳纤维电极，对多巴胺和儿茶酚胺有良好的电化学响应，有可能应用于单个人神经细胞中神经传递物质的检测。美国北卡罗来纳大学Jorgenson研究组于1987年提出用微型柱HPLC一伏安法进行单个神经细胞整体分析。采用直径15μm毛细管柱，直径9μm碳纤维微电极，进样5nl，检出限0．1fmol。并对陆地蜗牛单个脑神经细胞(直径约130μm)中多巴胺，5－羟色胺、酪氨酸，色氨酸进行了定量分离和测定。并测定了单个牛肾上腺素神经细胞中儿茶酚胺类化合物肾上腺素和去甲肾上腺素。此法仅用于单个神经细胞的整体分析，还不能用于活体分析及空间分析。但在定量测定时有较好的准确度和精密度。1992年斯坦福大学R．N．Zare提出的HPEC－CCD二维检测器用于生物微环境高灵敏分析、HPCE用于研究加州软体动物神经肽的特性；北卡罗来纳大学Whightman提出的测量单个细胞中激素分泌动力学。加州大学W．G．Kuhr提出的酶修饰超微电极测量活体中神经传递物质的动力学等。表明单个神经细胞分析化学的研究正在迅速发展。单个神经细胞分析除研究神经化学、神经生物学、神经药物学外，也应用于研究激素、新陈代谢，免疫系统等领域。现代临床医学为了加强临床诊断越来越依靠临床分析。在现代临床分析中生物传感器已经成为重要的分析技术。体外在线(on-line)阵列传感器系列已应用于临床分析，将取样针头直接插入病人血管中，流出的血液通过PCO2、H+、Po2、K+、Na+、电导、葡萄糖等阵列传感器测量，然后弃去，可以进行连续或间竭式测量。活体传感器将传感器装在大号针头内，直接插入体内，进行连续测量，是较理想的分析技术。在生物传感器研究中，研制能连续监测糖尿病人血液中葡萄糖的传感器，已经成为重要的研究目标。糖尿病人由于体内胰岛素分泌不正常，在一天内血糖浓度有较大的波动，造成高血糖或低血糖，给病人带来危害。将葡萄糖传感器植入狗体内，进行连续临测，已经成功地工作数月(G．Rcach等，1990)。人们希望将植入体内的活体葡萄糖传感器与植入体内的胰岛素泵相连接，可以自动连续监测和控制胰岛素释放，使糖尿病人的血糖保持正常水平，并能连续工作5a以上，将给糖尿病人带来福音。在临床及毒物学实验室已经更普遍测量痕量元素。实验室中最常测定的痕量元素有Cu、Zn、Cr、Se、Mn、Al、Pt、Pb和Cd，其中营养元素有Zn、Cu、Cr、Se和Mn；治疗元素有Pt和Al；环境污染元素有Pb和Cd。一般分析试样为血液、血浆、血清、尿、粪便、其它体液和组织中上述10－9级痕量元素。由于不须同时测定多种元素，实验室中最常采用石墨炉原子吸收法(C．J．Menendez-Botet．1991)。一些新的分析技术也日益受到重视，如ICP－MS用于测定脑组织中38种痕量元素(F．M．Corrigan等，1991)。在生物分析中应用ICP－MS已有评述(S．F． Durrant，1992)。毛细管电泳在临床分析中应用有明显增长(W．G．Kuhr等，1992)。细胞水平的分析技术正在迅速发展。如应用生物传感器测量细胞内外K+、Ca2+、
及Cl－等(J．．Janata，1992)。用卟啉修饰碳纤维超微电极(0．5～1μm)测定单个细胞中镍，检出限达0．6fg(B．F．Malinski，1991)；采用荧光检测的流动注射细胞分析(J．Ruzicka等，1992)，以及毛细管电泳分析蛋白质结合的钙及锌等(H．J．Kajiwaradfa，1992)。(武汉大学程介克、王宗礼撰)