【荧光素酶基因(1ux)在环境监测中的应用和研究】
现代生物工程学的发展为研究高效率的环境监测方法提供了理论基础和技术手段，已有不少新型生物监测系统投入使用，其中包括检测有害微生物的单克隆抗体技术，DNA杂交及PCR技术，监测化学污染物的Ames法和SOS法，以及发光细菌监测法等(陈声明等，1992)。 20世纪70年代，美国首次分离，Photobacterium phosphoreum细菌直接用于污水的生物监测。随后成功地用于多种类型污染物的监测。但是，发光细菌监测法也有其缺点。第一，已发现的发光细菌共有4类，分属于Vibrio，Photibacterium，Alteromonas和Xenorhabdus4属，它们都是海洋细菌，只有Xenorhabdus能感染陆生动物，因此对污染物的反应可能并不具备准确的代表性。在环境监测中，普遍认为选用对污染物有特定敏感性的细菌将会提高监测的灵敏性，而以上几类发光细菌对各种化学污染物均无特别的敏感性。此外，细菌生理状态的变化将直接影响到发光的亮度及检测准确性。第二，发光细菌法只能用于化学污染物的监测，而不能用于环境中有害微生物种群的监测，应用范围受到限制。另外，其监测灵敏性也有待提高。鉴于上述不足，近年来逐步提出利用基因工程技术对此方法进行改进，从发光细菌中克隆荧光素酶基因(Lux)，将其转入特定受体中表达，构建重组细菌或重组噬菌体，用于化学污染物及有害微生物的监测。发光细菌的荧光反应由胞内的荧光素酶催化，反应简式如下：
从生物化学的角度说，细菌发光反应需要氧、能源(来自还原态的黄素单核苷酸)、荧光素酶和长链脂肪醛。细菌荧光素酶由两个不等大小的亚基构成(α亚基分子量为40KDa，β亚基为37KDa)，两个亚基分别由细菌Lux操纵子的两个结构基因LuxA和LuxB编码。除此之外，一个典型的Lux操纵子还包括结构基因LuxC，LuxD和LuxE(G．S．stewart等，1992)，它们负责编码脂肪酸还原酶，以及负责Lux操纵子表达调控的Luxl和LuxR基因。研究认为Luxl基因产物在诱导发光系统的自诱导物形成中起作用，这种自诱导物在Vibrio fischeri菌中已证明是N－β－酮已酰高丝氨酸内酯，而LuxR基因产物则充当自诱导物作用的受体，此外，在个别的发光细菌中还发现有LuxF，G，H，Y等基因，编码生物荧光所需的特殊的酶或起调控作用。关于Lux操纵子调控的研究发现，诱导物在细菌胞内以特定的速度合成并在胞内积存，当积累达到一定数量时，它将会和LuxR基因产物作用而启动整个Lux操纵子的转录，诱导细菌发光。同时，转录形成的LuxI基因产物将能从正反馈形式进一步促进自诱导物的合成，并增进细菌荧光素酶的形成；但过高水平的自诱导物——LuxR基因产物复合物将会引起LuxR基因表达的关闭。可见细菌发光现象的调控涉及到正、负两种类型的反馈调节形式。大多数微生物缺乏荧光素酶基因LuxA／B和脂肪还原酶基因LuxC／D／E，因而不能发光。但它们均能够形成FMNH2，因此对于不能发光的细菌，如Escherichia coli，要转变成具有发光表型的细菌。在实际应用中，可以加以简化，通过向细菌培养基中添加外源长链脂肪醛，它能很容易地跨膜扩散入细菌细胞内，这样就只需在受体菌中表达2kb左右的包括有LuxA／B的基因片段即可以促成细菌发光。Lux基因用于细菌种群的监测：细菌数量及类别的监测是环境或食品监测中最基本的内容之一，例如水环境中E．coli指数就常被作为判断水质的重要标准。对环境中细菌的监测一般都涉及到细菌的恢复培养和鉴定等多个步骤，近来虽有许多改进，但方法仍然耗时耗力过大，而且由于部分细菌不能在培养平板上迅速恢复并形成菌落，监测的准确性不够理想。一些新兴技术，如DNA杂交及PCR技术，又过于昂贵和繁琐，很难在目前条件下普及推广。1987年S．Ulitzer等提出了一个利用Lux基因进行细菌监测的全新概念，将Lux基因通过基因工程手段从发光细菌中克隆出来并整入到细菌专一性的噬菌体基因组中，含有荧光素酶LuxA／B基因的基因工程噬菌体不能发光、因为它尚缺乏发光所需要的细胞内的特定生物化学环境，但一旦这种工程噬菌体感染了其专一性的宿主细胞，它将能够将其携带的荧光素酶基因转入细菌中表达，并使细菌发出可见的荧光。这一新型的监测系统利用了噬菌体和细菌之间的特殊进化关系，至少具有两个明显的优点：一是监测速度快，一般在20～30min内就能够测出被检细菌的存在，而不必长时间等待平板上菌落的形成；二是监测专一性强，因为某一种噬菌体只能感染特定的宿主细胞，一旦出现荧光，即可判断样品中存在被检目的细菌，省去了常规细菌监测方式中繁锁的细菌鉴定的操作。Ulitzer等(1987)曾从发光细菌V．fischeri MJ1中分离到一段9kb的Lux操纵子基因，转入E．coli噬菌体基因组中形成基因工程噬菌体L28用于E．coli的监测，检测极限可低达10个细菌，时间约需100min。利用类似的方式，G．S．Steward等(1989)也构建了对Salmonella typhinuriunm专一性的重组噬菌体，用于环境样品中沙门氏细菌的监测，也获得了满意的结果。关于此方法的可靠性，Steward等(1990)曾设计对照实验检查了Lux重组噬菌体法和标准的平板菌落计数法的监测结果，发现两个监测方法所获的结果有显著的相关性，但通过平板菌落计数法监测需要18h，而Lux重组噬菌体法只需50min。病毒学的研究已发现对于大多数环境致病菌，如Salmonella spp．，Campylobacter spp．和Legionella monocyto genes等，都有其专一性的噬菌体，这为进一步研究和应用Lux重组噬菌体法提供了理论的和现实的可能性。对于环境中大量的非致病菌，也可通过监测指示菌来判断其数量。此外，Lux重组噬菌体一旦构建成功，将很容易通过细菌裂解液大量获得，保存和使用都较为方便，这些都显示了Lux基因重组噬菌体法的明显优势和强大的应用潜力。Lux基因用于杀虫剂的监测：杀虫剂广泛用于工农业生产，环境保护和人民生活的许多领域的害虫的控制。但由于这类物质的毒性较大，它残留或污染也会对环境保护及人类健康产生不利的影响，因此对其在环境及食品中的残留和浓度进行快速而准确的监测便显得格外的重要。利用基因克隆技术将LuxA／B基因转入对杀虫剂敏感的受体菌中表达即形成了一个快速监测系统。常用的受体菌是E．coli，例如发光的基因工程菌E．coliNCTC8196已成功地用于多种杀虫剂的残留量监测。此生物监测系统所依据的原理是：低浓度的杀虫剂虽不造成细胞的死亡，但它能够抑制细菌的正常的生理生化反应，因而造成细菌发光强度的改变。由于杀虫剂浓度和光强度下降之间存在一定的正相关关系，通过测定细菌发光强度的下降值，即可定量求算环境样品中杀虫剂的浓度。对于高浓度的杀虫剂，由于其作用直接造成细菌的死亡和荧光的丧失，则可以通过研究其死亡动力学并建立以杀虫剂浓度为函数的细菌10倍减少时间曲线，根据它判断被监测杀虫剂的浓度。在实际应用中，测定时间一般只需5～10min，且具有很好的准确性。Lux基因用于抗生素的监测：在多种微生物发酵工作中，常会出现细菌培养物为污染的抗生素，表面活性剂或噬菌体所抑制的情况，需要快速确定抑制物的种类和浓度。通过将Lux基因克隆入乳酸细菌中表达，K．A．Ahmad等(1988，1991)构建成了用于乳制品中抗生素监测的新型工程菌株。他们从V．fischeri中分离得到LuxA／B基因片段，并接到一个来自Lactobacillus casei启动子片段上，再用一个PCK1衍生的穿梭质粒作为表达载体，通过电穿孔技术转化L．casei，Lactococcus lcatis和L．lactis二乙酰乳糖亚种，获得的三株转化子均能呈发光细菌表型，通过观察抗生素对这些敏感工程细菌发光的抑制，可在60min内检测出污染的抗生素浓度。类似方法获得的发光E．coli工程菌也已用于氨苄青霉素、氯霉素、多粘菌素和头孢霉素的快速监测，监测浓度极限依次为0．5，0．2，0．15和0．05μg／ml，效果不错。Lux基因用于重金属的监测：M．Korpela等(1988)从发光菌V．harveyi中克隆出LuxA／B基因转入E．coli中，使其在乳糖操纵子Lac启动子控制下表达，获得的发光工程菌用于二价钴的测定，检测极限为47．5ppb，所需时间为2h。类似的发光工程菌E．coli用于二价汞的检测，极限为5ppm，所需时间仅为15min。上述应用实例中所依据的原理主要是各种污染物能够抑制Lux基因工程菌的生理代谢并进而影响发光强度的变化，并没有考虑细菌对污染物的抗性或降解性的因素。1990年Burlage等进一步完善了这一监测系统。现代的研究发现，在长期的进化过程中，许多细菌都获得了对污染物的抗性或降解性基因，这些基因的表达能够被低浓度水平的污染物所调节或诱导，以此作为理论基础，他们利用来自Pseudomonas putida NAH7质粒的启动子Pnah和来自V．fishchdri的LuxCDABE基因融合后置于P．Putida中。该工程菌在环境中存在极微量萘时，由于萘能诱导Pnah启动子启动NAH7质粒的转录和翻译，产生降解萘的酶，处于此复制子中的荧光素酶基因也将获得表达并产生可见的荧光。由于这种沉默基因表达的激活可以在污染物浓度远低于能对细菌生理生化过程产生抑制作用前就发生。因而大大增加了监测的灵敏度。利用来自Pseudomonas spp．和TOL质粒启动子和Lux基因融合，已获得了对甲苯和二甲苯高度敏感的监测菌株。根据同样的原理，H．H．Moelders等(1990)发展了一项汞的高灵敏性监测系统。细菌对汞的抗性依赖于汞结合到mer R抑制基因产物上并激活merR基因的表达。Moelders将LuxA／B接到merR基因的右方向启动子上，构建成的工程株对汞的监测极限可低至0．2×10－9，远低于依赖汞对发光工程菌产生抑制作用所获得的5×10－6的监测极限，灵敏度提高了2500倍，此检测极限也优于目前所知的所有化学方法，如原子吸收法等，基因工程技术的发展，尤其是PCR技术的应用，使人类能够更加快速而准确地分离和克隆各种控制污染物降解或抗性的启动子基因序列，因此通过构建启动子／荧光素酶基因嵌合基因，利用低浓度污染物能诱导“基因开关”的特性，将为污染物的监测提供一个更为灵敏、专一的方法。Lux基因克隆和转化的研究中，大部分是采用质粒作为表达载体，导入的Lux基因独立于细菌核染色体而复制和转录，具有两个缺点：一是质粒拷贝数容易改变，较难控制由拷贝数扩增、基因剂量改变造成的荧光强度的变化，部分降低监测的灵敏性；二是有些污染物的降解性或抗性并不处于质粒上，为制备“基因开关”增加了难度。有人尝试用噬菌体转导或将Lux基因插入转座子Mu，Tn5和Tn4431或某些易和核染色体发生重组的质粒中等方法促使Lux基因嵌合入核染色体中(E．A．Meighen)，以减少因基因剂量改变造成的灵敏度下降。但是，由上述方法组入核染色体的Lux基因在位置上有很大的随机性，仍有所不足。理论上的最佳方式是将Lux基因组入核色体中编码污染物抗性或降解性基因启动子的下游，这样将能圆满解决这一矛盾，但其实际操作还有待于对细菌核染色体中降解性或抗性基因的组织、结构的深入了解及相关技术的发展才能实现。荧光素酶作为一种报道基因已广泛应用于基因工程研究的许多领域，但仍存在一些问题有待阐明，例如如何确保外源荧光素酶基因在对污染物有特殊敏感的宿主菌中高效而稳定地表达，以及外源Lux基因表达的调控等。因而这一领域的理论和应用研究将会更深入，最终为环境生物监测展现广阔的前景。(中国科学院上海植物生理研究所张蔚文撰) |