【生物光化学】
光感受体(即感光的物质)的光化学，光感受体范围广，功能各异。物质受光激发后则处于激发态。
紫外光(UV)对生物大分子作用的研究经历了3个阶段：早期用253．7nm(即254nm)波长光；中期用的是UV光解技术；后期即80年代后用激光冲光作为光源。早期研究从光化学角度主要研究造成蛋白质变性、肽键与氢键以及二硫键的断裂、脱羧与脱氨基作用，甚至酮和醛的分解。UV对蛋白质及酶的作用，得出的结论是其中的芳香氨基酸(尤其是色氨酸)与胱氨酸对照射敏感。用UV闪光光解技术作用于蛋白质，由于往往是在水溶液中进行，所以可引起光离解，因此反应中可检测到水化电子。现在常用265nm波长的激光，延时有3ns与15ns，也有用微微秒(ps)的。毫微秒UV脉冲激光对中性水溶液中的酪氨酸(tyr)与苯丙氨酸(phe)的作用都是双光子作用，并且都通过三重态(即3tyr氨与3phe)完成，但在碱性条件下为单光子过程。水化电子量效率
，前者是0．095；后者是0．15。色氨酸与前两者不同，光电离的最初反应是单光子过程，电子是从较高的电子激发态(SN)或从最低激发单重态(S1)较高振动能级释放的，双光子过程的贡献很小。但在低温玻璃态(77K)则主要通过色氨酸三重态实现双光子过程，但此时用的是非单色光(D．V．Bent等，1989)。L．I．Guosswiener(1982)用265nm波长脉冲激光光解一些酶得到的产物，如tyr·与trp·的量子效率之和等于
与RSSR的量子效率之和，说明酶的原初光解过程就是光离解。进一步实验指出，色氨酸水溶液光解可以是单光子也可以是双光子过程，但在普通UV光强下则为单光子过程。用265nm(UV)与5nm(G)双波长光照射可以证明上述的结论。用265nmUV(17ns延时)照射色氨酸溶液，光离解产生水化电子的量子效率可为(UV+G)的双激发而提高，单独UV照射
也可为加热而提高。但是(UV+G)照射在20～80℃范围内，色氨酸产生的水化电子的量子效率是恒定的。色氨酸单用UV照射在高温(80℃)下，其
可以达到(UV+G)照射时的大小。由此说明，UV照射的单光子离解过程在热作用下会跟双光子过程竞争。酪氨酸与色氨酸不一样，单用UV照射就有双光子过程。因为将tyr与trp光离解最初形成的
与用2654nm波长单光子过程对铁氰化钾作用产生的
比较，对trp而言，单用UV照射呈直线，用(UV+G)照射呈向上弯曲的线；但对tyr而言，两种情况都为向上弯的曲线，以表明双光子过程。对于上述结果的解释是：吸收一个光子可以产生一个短寿命的中间产物(X)，此中间产物可为光再活化也可为加热而活化。这一中间态称为CTTS态，即电荷转移到溶剂的一种状态。电子从CTTS态形成仅能在高介电常数环境中发生，如乙二醇－水溶液在玻璃态时，色氨酸受照射时的
，但在室温下
，这是因为在室温下，水的介电弛豫快，
增加。(UV+G)联合照射各种酶、芳香氨基酸，光离解的量子效率都很高，说明这些蛋白质光离解都是双光子过程。G．Grabner等(1991)用不同延时不同波长的激光照射血卟啉水溶液，
的大小，在0．2～＞1000mJcm2激光能量范围内，决定于激光能量。当用毫微秒266nm与355nm两种波长分别照射时，水化电子主要是由双光子过程形成。在单光子过程中，
，大于
；也就是说，335nm单光子几乎不形成水化电子。在双光子过程中，用355nm(30ps)照射比用355nm(10ns)照射时
要大。只用532照射则无水化电子产生，上述不论是单光子还是双光子过程，
都随血卟啉浓度增加而降低。激光对蛋白质与酶溶液作用可产生水化电子，这些水化电子可对蛋白质及其组分作用。但是水化电子的产生途径以及水化电子对蛋白质的作用机制及详情仍，需要进一步研究。核酸的嘌呤与嘧啶碱基吸收200～300nm的紫外光，但长期以来都是用254nm波长研究UV对核酸的作用。核酸组分在室温容液中荧光寿命只有1～10ps，量子效率低。早期研究UV对核酸作用的光化学，只知道有氢键的断裂，股间的交联，嘌呤碱基吸收的能量可以转移给嘧啶碱基或糖－磷酸，骨架而引起进一步的化学变化。60年代后期，由于发现在UV照射下形成一些光产物，因此开始重视对产物形成的分析，最初发现的是光水合物，以胸腺嘧啶(T)为例，即在5，6双键上加一个水分子，以后又发现在5，6双键上形成环丁烷二聚体TT但量子效率较低。而6，4嘧啶－嘧啶酮光加成物(非环丁烷二聚体)的量子效率比二聚体还要低很多。光水合物是由激发单重态形成，而环丁烷二聚体是由三重态形成。但嘧啶三重态寿命很短τT=2μs，系间为窜越及磷光量子效率(Φisc及Φp)都很低。胸腺嘧啶及密嘧啶在水溶液中Φisc分别为0．006与0．02。真空紫外：由于激光光源的兴起，经常用的是短波紫外光，如248nm，266nm等等。由于新光源的发现，可以产生＜200nm波长的远紫外光，所以乃建立了真空紫外光化学。用ArF激发二聚体可产生193nm波长的紫外激光(I．E．Kochebuar等，1990)，而同步辐射加速器可产生130nm波长光。193nm的UV已应用到外科手术即用来割去皮肤。193nmUV可此起DNA股断裂，碱性易变位与核酸内切酶易感产物，但它不引起变异的光产物。193nm对水是透明的，不为水所吸收，能量全由DNA吸收。193nmUV形成二聚体的量子效率比254nm没长要低10倍，而股断裂等量效率则很高。Kochevar与L．A．Buckley(1990)报道，193nm对质粒DNA作用可通过单光子过程发生光离解，形成单股断裂的量子效率可达9×10－5。193nm与254nm波长比较，除具有对皮肤较低的穿透力外，还具有较低的毒性与致突性，这是因为它比254nm波长形成的二聚体少的缘故。超短脉冲激光与双光子的作用：1963年，1963年，K．H．S．Baddasaryan等发现在冰冻状态下用低强度UV照射有机分子时有两步激发，后来又发现由较高三重态形成的光产物的量子效率与光强的平方成比例。借助两步激发就有较高激发态布局，它们可能具有约6～10eV的能量，从而导致原初光化学过程如光电离以及溶剂的敏化离解。1979年D．G．Kuyukov在开始用微微秒UV脉冲激光(I1013Wcm－2，τp=29ps，λ=266nm)照射胸腺嘧啶水溶液，发现第1跃迁的吸收有不可逆的降低，再用240～300nm波长照射得到的差光谱与胸腺嘧啶的S0→S1的吸收带完全一致，说明激光照射后形成的产物不吸收266nm波长光。以后他就用△D／D光密度值为指标，进一步两个波长研究了胸腺嘧啶稀水溶液，一个波长是266nm(能量=10mJ τp=20ps)，另一波长为532nm(能量=10mJ τp=25ps)，结果单独用266nm脉冲光照射可看到，样品的光密度在低光强时增加到高光强时达饱和。若同时用532nm波长照射，可加强在低光强下光密度的变化。若两种波长光间隔100ps，这种加强作用消失。由此可见，两个波长同时照射时，由266nm脉冲光产生的一个中间激发态可吸收532nm脉冲光而处于更高激发态，而且中间激态寿命很短，因此两个波长相隔100ps时，后一波长就没有效果，从而证明这是一个两步激发的过程。Kryukor等还证明，高强度ps脉冲激光对胸腺嘧啶的光解产物与低光强UV产生的光产物，在质与量上都不一样。所谓两步激发，就是使已经处于S1或T1能级的激发态分子再吸收第2个光量子而处于更高激发态。这就是需要发处于更高激发态SN与TN的速率大大超过S1或T1的失活率。这一要求可有两种条件满足：一种是用强激光光源增加激发率；另一种是在低温冰冻条件下增加S1或T1的寿命。1989年，F．N．Dobbrove等对不同能量和脉冲延时的UV对质粒中核酸单股断裂，RNA交联与核苷酸中的糖苷键的断裂等进行了比较，结果表明，在高强度中能量大的比较量小的量子效率要大，它们又比低光强UV量子效率大。自1979年后经过多年实验后，已经了解两步激发可以有两条通道达到更高激发态即通过S1→SN，也可通过T1→TN。现在已基本肯定，用ps脉冲激光激发产生高位的SN，即：
而用ns激发，虽然可产生SN与TN两者，但主要是产生高位的TN，所以它的通道是：
在这一通道中存在系间窜越过程，所以光化学的量子效率的量子效率一般比S1通道的两道的两步激发低，换言之，即毫微秒比微微秒脉冲光的光化学量子效率低。上述实验也说明这一点。
UV激光对核酸股断裂的作用：UV脉冲激光对DNA股断裂包括单股断裂与双股断裂。这方面的研究目的是了解UV对细胞及细胞内核酸的作用机制。1980年，D．A．Angelov证明，用微微秒UV脉冲光照射核酸组分的水溶液，双光子作用可使水光解产生一些产物，并且参与了核酸组分的分解；还证明胸腺嘧啶在水溶液中光解的量子效率决定于溶液的浓度，浓度降低光解的量子效率增加，证明双光子对水的光解产物参与了胸腺嘧淀的光解。但1987年O．N．Nikogosyan证明，毫微秒UV照射胸腺嘧啶水溶液，双光子解水的产物不参与胸腺嘧啶的光解。Hgorner用244nm与266nm两种波长的毫微秒与微微秒强激光照射核酸水溶液可产生水化电子，
在低光强时随光强增加而呈线性增加，说明水化电子与碱基阳离子对可由双光子激发产生。Nikogosyan则认为，光强超过109Wcm－2，水化电子的量子效率也会下降。并且ps激光对poly(U)的ssb形成也是如此，即Φssb会由于饱和效应而降低。用250nm波长低光强的UV照射多核苷酸、DNA与RNA形成ssb的量子效率很低，约为10－6，这是单光子作用。若用较低高光强(107Wcm－2)或较高浓度核酸(～10－4mol／L)测量，由于碱基受激发形成碱基阳离子基团乃导致单股断裂。用高强度激光，不论是用ns还是用ps脉冲光，对单股断裂形成有两种看法：一种看法认为其形成是由于碱基阳离子基团的作用；另一种看法则认为是OH·作用的结果。D．V．Nikogosyan研究了在无氧条件下双光子对单股断裂形成的作用。因为在溶液中受毫微秒脉冲激光的光离解可形成水化电子，在有N2O时这些电子乃转变成OH，后者作用于核酶形成单股断裂。实验指出，若在溶液中加入足够的N2O，使所有水化电子都清除掉，则各种不同的核苷酸的Φssb都可增加一倍。核酸受UV作用也可引起双股断裂，这有两种可能：一种是由单个离解直接形成；另一种是两个独立的光离解分别形成两个单股断裂，因而是一个积累过程。但核酸与核苷酸单股断裂形成尚无定论。一般而言，凡是能发荧光的物质都能发磷光，但一般不一定能检测到。近年来发现，只要很好地去除溶液中的氧，在室温下可测量磷光。磷光由三重态产生，测量三重态可以反映蛋白质的特性。测量三重态和磷光有下述几种方法：(1)当三重态寿命很短时(ns～ms)，可用三重态－三重态吸收法(T1－TN)，用T1－TN吸收法测得木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等色氨酸的三重态。HSA含有一个trp残其，其τT=0．5ms；BAS中含有两个trp残基，无氧时τT分别为0．5ms与6ms。(2)三重态寿命较长即大于ms时，可用直接测量磷光的方法研究。最早测定的是马肝中的LADH(乳酸脱氢酶)以及大肠菌中的碱性磷酸酶(AP)，许多关于室温下蛋白质磷光的知识都是从此两种酶得到。(3)三重态寿命可通过部分漂白基态的恢复间接检测到，此即TAA法。(4)延迟荧光(DF)，方法有两种：一种叫P-type DF，即三重态－重态湮灭法；另一种叫T-type或E-type DF，即T1－51－S0过程。T-type DF的强弱决定于三重态激发单重态间的能量差。(5)光学测定三重态磁共振方法(ODMR)，此法基于三重态在磁作用下可分裂成3个亚能级。其布局不同有不同的磷光，需要在2K中进行。蛋白质的磷光可用做蛋白质结构和动力学的探针。蛋白质在溶液中的长寿命磷光反映色氨酸处于相当坚固的微环境中。许多球蛋白的磷光对温度都有依赖性，即在170K以下，温度升高对磷光只有很小影响，温度高于170K或更高，磷光寿命就降低，当溶液变成流体时暴露的色氨酸的磷光则被溶解氧猝灭，所以室温下Φp只有低温下的10－2～10－5。温度升高磷光峰位会移向长波长。室温下的磷光多是从埋藏trp发出。一般而言，在无猝灭剂时埋藏的Trp衰减时间较长。凡含有一个色氨酸的蛋白质都具有相当长的磷光寿命，但荧光峰位则蓝移，这是由吲哚微环境的疏水性造成，同时说明了长寿命的磷光团深埋藏在蛋白质内部(G．B．Stranbini，1990)。对蛋白质中的色氨酸三重态的猝灭也是一种反映蛋白质微环境和动力学的探针(N．E．Gcacintov等，1989)。氧既是磷光的猝灭剂也是荧光的猝灭剂。荧光的双子猝灭常数sKq与双分子碰撞速率常数Kd相等。但溶液中三重态猝灭常在正常状态下蛋白质不允许氧穿过，但是在瞬间结构涨落时，蛋白质仍成为“开放”状态，使Trp暴露于猝灭剂下。由于氧对色氨酸磷光不受扩散速率限制，因而氧也与蛋白质的挠性有关。丙烯酰胺对蛋白质发光的猝灭常数也是sKq＞tKq，而tKq对蛋白质中Trp埋藏程度较不敏感，这可以通过单重态猝灭是长程作用而三重态猝灭是短程作用来理解，但是丙烯酰胺的猝灭作用与距离的依赖性仍需进一步研究。D．D．S．WCalhoun等用不同大小的猝灭剂分子对10种蛋白质磷光猝灭的结果是：当Trp埋藏程度增加，小分子猝灭剂的tKq降低到最小；中等大小的猝灭剂的tKq则有较大的变化，即易感性大；大分子猝灭剂的tKq也减小。Calhoun还用大分子猝灭9种蛋白质磷光，发现对同一种蛋白质不同猝灭剂的tKq相同，从而说明猝灭决定于蛋白质而不决定于猝灭剂。(复旦大学程极济撰)