| 单词 | 植物原生质体培养理论与技术研究 |
| 释义 | 【植物原生质体培养理论与技术研究】 拼译：theoretical and technical advances in plant protoplast culture 细胞壁具有多种功能，对植物的生命活动以及对人类与自然界都有很大影响。但是由于它们的存在也曾给植物细胞生物学的研究带来一定困难与复杂性。早在18世纪就有科学工作者用机械法除去细胞壁以期得到裸露的植物细胞——原生质体(protoplast)，但是进展甚慢；直到20世纪60年代酶法分离原生质体获得成功才促进了近代植物原生质体研究迅速发展，成为生物技术中重要的研究领域之一。目前已知植物原生质体及其衍生系统不仅是探索生命活动理论研究的良好体系之一，还可以通过对其进行各种细胞操作及遗传操作，从而改良农作物或经济植物的某些性状，在生产和应用上有巨大潜力。植物细胞离体培养时具有全能性，这是一个重要功能。经过科学工作者的努力试验，曾在多种植物，约2000余个例证中得到肯定，已无可怀疑。在植物原生质体培养研究的发展过程中有几个值得提出的成就：(1)Hanstein(1880)首次起用原生质体(protoplast)一词。(2)Cocking(1960)首次用酶法制备番茄根原生质体获得成功。(3)Takebe等(1971)首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。(4)Fujimura等(1985)获得第1例禾谷类作物——水稻原生质体培养再生植株。(5)Spangenberg等(1986)获得甘蓝型油菜单个原生质体培养再生植株。 近10多年来植物原生质体培养取得了可喜的结果。据比较准确的统计，到1989年有分属于31个科、96个属的212种植物经原生质体培养得到了再生植株；而1993年已增加到分属于49个科、146个属的320多种植物。其趋势仍以农作物和经济植物为主，但从一年生向多年生、从草木向木本、从高等植物向低等植物扩展，如食用菌、藻类进展也较快。除了原生质体培养的理论与技术有所改进外，其它有关细胞、分子、遗传等学科的成就也与之交叉渗透并起了相互促进的作用。经过多年来大量的试验分析，对于影响原生质体能否离体培养得到再生植株的众多因素一般可以归纳为3个环节：即基因型的选择，原生质体来源的选择与培养基、培养方法和培养条件的选择。这3个环节一旦环环相扣就可以获得成功。在各类植物的原生质体培养时对这3个环节的选择是有不同的。对比较容易培养的植物不同基因型的影响不大，例如烟草属有些不同的种或品种的原生质体在培养时对外植体或细胞系的来源、培养基的种类与组分、培养条件和方法等可以相似。而难以培养的所谓“困难植物”，例如禾本科的一些种或品种在这3个环节中的某些因素常有不同的要求，需要修改才能获得成功。基因型的影响 近来，不同基因型对植物原生质体培养的影响已开始有些深入的工作。较早的试验曾经证明矮牵牛叶肉原生质体的不同生长发育时期是受不同基因所控制。通过番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定的。Cheng和Veilleux(1991)对芙薯(Solanum phureja)原生质体的培养能力也做过遗传分析，并证明从原生质体培养到形成愈伤组织是受2个独立位点的显性基因所调控。Dudits等(1991)用苜蓿(Medicago sativa)不同的基因型做了较深入的研究，认为有某个基因型在离体培养时难以形成体细胞胚。但是，如果将对激素调节有作用的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolB和rolC基因引入并表达，就可能促使其体细胞胚形成。虽然这些结果都是初步的，有关工作还刚刚开始，但已可以看出基因型对原生质体培养的研究已从组织和细胞水平的探索向分子水平深入。原生质体的来源 制备原生质体的供体取用于植株的各类器官、组织、细胞或是由之建立的细胞无性系。同一基因型的植株生长在不同的环境条件(光照长度、光强、光质、温度、湿度、营养、……等)中，它们的生理状态会有改变。即使是生长在相同的条件下用各种类型的外植体如叶片、胚轴、根尖等制备的原生质体，甚至是同一类型外植体所制备的原生质体，在离体培养时对各种培养基或培养条件的反应也会有不同。因此，供试植株最好生长在控制条件下，可以提高原生质体的细胞分裂率和再生能力。有人比较过向日葵幼叶、子叶或下胚轴原生质体的培养情况，结果只有下胚轴原生质体培养后得到了细胞团和形成体细胞胚，而前两种来源的原生质体甚至未能细胞分裂。也有报道从苜蓿品种Ardiana幼苗的根原生质体经培养可直接通过体细胞胚形成途径得到再生植株；如果用叶片或下胚轴诱导的细胞悬浮系原生质体则必须先形成愈伤组织后再经诱导才能形成体细胞胚。至于禾本科植物，尤其是众所关注的禾谷类的原生质体培养难度就大得多；在80年代以前虽经多方面的大量试验但终未能成功。因此形成了两种看法。一部分科学工作者对于是否所有植物的细胞，特别是单子叶植物的叶肉原生质体仍具有细胞全能性产生了怀疑。另一种意见认为上述看法不当，失败的原因只是由于对有些植物原生质体所要求的培养条件和培养技术等不合适，还没有掌握，所以得不到再生植株。后来Vasil等(1980)改用胚性悬浮细胞原生质体在美洲狼尾草(Pennisetum americanum)获得成功，Fujimura等(1985)首次得到水稻原生质体培养的再生植株。以后陆续在水稻(粳型、籼型、糯性、非糯性等)、小麦、大麦、玉米、高粱、谷子以及一些禾草类都得到了再生植株，例证有10多个品种和种。应当说后一种看法已可以认为是正确的。但是上述的禾谷类和禾草类成功的试验都是采用胚性悬浮细胞原生质体或采用胚性愈伤组织原生质体，因此还曾留下一个悬念。由于禾本科和禾谷类的叶肉原生质体培养长期未成功，它们是否有全能性仍没有被证实，更何况叶肉原生质体有制备方便、不需要长时间选择和先离体培养等优点。对此问题近年来终于初步得到解决，是一个可喜的进展。Cupta等(1993)用6个水稻品种8d龄的无菌苗叶基或叶鞘原生质体进行液体／固体饲喂培养，已从4个品种得到了再生植株。这个工作的结果说明了过去有人认为禾本科叶肉原生质体丧失了全能性，并推想是由于细胞的DNA丢失或片段化引起了基因组改变而导致不能进行细胞分化的看法是根据不足的。水稻叶肉原生质体能有全能性表达的例证还为进一步开展其它禾本科植物的有关研究提供启示，十分值得注意。如果禾本科叶肉原生质体培养的水平可以赶上和超过模式植物，就有可能少用或不用胚性细胞系为制备原生质体的材料，能缩短整个培养时间，有助于减少体细胞克隆变异。除此之外，在有些植物经离体培养脱分化的或已分化的组织所制备的原生质体群体中除了二倍性等整倍数的细胞核外也可能有非整倍数的细胞核，这会增加培养的复杂性。原生质体培养的生理问题 从细胞的角度看，植物原生质体培养时涉及了几类问题，如逆境反应、修复机理、脱分化、细胞分裂与形态发生等。1．逆境反应。这是细胞对外界刺激或诱导，如受伤、感染、高温、辐射等产生反应，涉及自御机理。由于细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂，因此可以产生活化氧，引起脂类过氧化，减少细胞的流度同时伴随着胞质膜的泄漏。有的报道向日葵原生质体的再生能力与此类损伤成负相关。细胞对此类逆境反应一般会快速地产生涉及诱发不同代谢途径(例如苯基丙烷途径，phenyl-propanoid route)的酶系统，结果形成了植物抗毒素(phyto-alexins)和如木质素一类的结构多聚物。也有报道在原生质体分离时，编码泛性蛋白(ubiquitin protein)、类伸展素蛋白(extensin-like protein)、过氧化物酶，还有蛋白酶抑制物的基因立即活化。刚分离的烟草原生质体会产生二个几丁质酶、二个渗透蛋白(osmotin protein)和一个葡聚糖酶。有些逆境反应对原生质体制备是不利的，例如在甜菜原生质体制备时脂肪氧全酶(lipoxygenase)活性产生，形成类脂过氧化物(lipid peroxides)，结果引起原生质膜的氧化损失。而对马铃薯原生质体活力的损伤乃由于乙烯产生所致。由此可见，原生质体在分离过程中产生逆境反应的性质是决定它们以后在培养时全能性能否进一步表达的重要因子这一，需要深入研究。2．修复机理。在原生质体分离时会丢失一些不同的细胞结构。最明显的是失去了细胞壁，细胞壁是细胞形态和模式的一个重要因子，没有了以后使原生质体中细胞骨架的组分、结构和方向会发生变化，最常见的是引起细胞极性的改变，同时也会干扰质膜的蛋白质系统。质膜含有蛋白质复合体，其作用是有机物的运输、离子进出细胞和识别各种外来的信号。由于用于脱壁的酶中多少杂有蛋白酶，膜蛋白体可以是部分分布或全部分布，因此分离的原生质体只有在重新合成这些蛋白质复合体后才能有功能。各类原生质体修复其质膜及其中蛋白质组分的能力、细胞壁和细胞骨架都对它们能否进一步发育有很大影响。3．脱分化。分离的原生质体原来的细胞状态是会影响脱分化的进行。例如马铃薯组织的原生质体含有大量的淀粉体，只有当这些淀粉体被代谢了以后才能见到细胞分裂，这个时间约需7d才能完成。而烟草叶肉原生质体的叶绿体的脱分化过程则需要好几个细胞周期，但与第一次细胞分裂的诱导并无必然联系。通常叶肉原生质体含有许多叶绿体。烟草叶肉原生质体分离后叶绿体显示出明显改变，体积减小而晶体内含物与类囊体消失。这些原生质体的细胞质也改变了：中央液泡消失、细胞体积增加、细胞成为富含细胞质，其中有不少核蛋白体。细胞核在制备前后大多是浓缩的，此时体积增大。开始培养时有不浓密的染色质出现，原生质体脱分化成为类似分生组织状态的细胞。4．细胞分裂。细胞骨架联系着细胞内各细胞器和其他胞质组分以及质膜。细胞壁与细胞骨架和细胞分裂、细胞分化密切有关。由于微管参与调节细胞形状及决定细胞分裂的平面与位置，因此它在植物形态建成中起着重要作用。Fowke等(1990)在云杉(Picea glauca)胚性原生质体培养中观察到微管的构成与细胞分裂有相关性，Dijak和Simmonds(1988)从苜蓿叶肉原生质体直接形成体细胞胚的观察中也证明这一点。形成一个完全新的细胞壁一般需要2d，从哈甲豆(Vicia hajastana)快速生长的悬浮细胞制备的原生质体在2d内可有细胞分裂，但在子细胞中遗传物质的分布有些很不规则(Simmonds，1991)。这些结果肯定了细胞壁在细胞分裂过程中的必要作用。一个原生质体能否进入细胞分裂也依赖处于细胞周期的什么时期，如白花丹烟草的叶组织如果大多细胞处于G2期，则所制备的原生质体以后会有较高的细胞分裂能力(Magnien等，1982)。棉花的子叶原生质体的G2期与细胞壁形成及细胞分裂有高度正相关，而如处于G1期则会无此相关(Firoozabady，1986)。矮牵牛叶肉原生质体在制备后18h重新开始RNA合成，其RNA浓度可增高到对诱导DNA复制和细胞分裂所必需的浓度(Bergounioux等，1988)。由于细胞的异质性，从一群原生质体可以经离体培养形成多种类型的愈伤组织，如坚密、松散、颗粒状等各种形态。加上多种激素对比和调控，不少植物的原生质体可以在经诱导形成不同类型的愈伤组织如胚性、非胚性或中间型以后，通过体细胞或分化芽根途径完成细胞全能性表达。5．其它因子。外界因子如各种培养基的组分与各种附加物、培养基的H+浓度、植板密度、培养方法、培养时的光照和温度等条件都影响原生质体培养和再生植株过程。采用任何一种原生质体培养技术的目的都在于：(1)促使愈伤组织诱导率、分化率增加，使所培养的原生质体能有全能性表达。(2)得到重复性好、植板率和再生植株能力高、生长良好的再生物。(3)促使重要农作物和经济植物等的原生质体培养能够系统化或程序化以赶上模式植物。(4)为其他生物工程研究提供良好受体系统、为理论深入提供素材。目前在植物原生质体培养技术的发展中应当注意研究的是：低密度和单个原生质体培养，原生质体衍生系统如微小原生质体、胞质体、核质体的利用，计算机系统、流式细胞光度计等技术的应用，各种附加剂影响的原因等。总之要掌握原生质体培养的3个环节，同时深入开展机理和扩大应用的研究。植物原生质体培养一定会取得更大成就。【参考文献】：1 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