| 单词 | 基因枪转基因技术 |
| 释义 | 【基因枪转基因技术】 拼译：the technologe of microprojectile bombardment gene transfer 高速基因枪是用于把外源基因直接导入细胞和组织的微粒子枪。基因枪转基因技术是美国Sanford等于1987年建立起来的。其后许多实验室报道了载有外源DNA的微粒子可被直接导入带壁植物组织和细胞。它不受寄主的限制，无基因依赖性，从而使许多难以导入外源基因的重要粮食作物的基因转化成为现实，推进了植物基因工程的进展。 自1987年Sanford等报告基因枪转基因技术以来，许多实验室对其机理和转化系统进行了研究。现已基本弄清其作用机理，并已在玉米、大豆等作物上获得转基因植株。基因枪转基因的基本原理是有一套加速系统。最初是以火药爆发气体推进一颗塑料射弹，使其达到350～680m／s的高速。塑料射弹由前端的挡板止住．挡板中央有一小孔，射弹前端面上附着的载基因粒子(通常是金粒或钨粒)在冲击波及惯性的作用下高速通过小孔射向组织细胞，穿透细胞器膜，留在细胞器中，从而将外源基因导入细胞并整合到核基因组或细胞器基因组。也可利用弹前冲击波直接发射载基因微粒子，以获得更佳的微粒子的分散度和力度。由于采用的微粒子化学上惰性的超细金属粒子，因此，大部分细胞被轰击转化后仍能正常生长发育，机械损伤至死的细胞很少。因此适用于各种植物组织细胞，如花粉、胚胎、叶片、分生组织和悬浮细胞培养物。运用基因枪转基因技术，首先是成功地将外源基因导入洋葱、玉米、水稻和大豆细胞并获得短暂表达。在这之后，大量的报道集中在大豆和玉米两种作物上。MaCabe等报道，他们获得0．05%的大豆转基因芽，进而获得转基因植株。外源基因在大豆的花粉和子房中得到稳定表达，并且以无基因依赖性而优于以农杆菌为介导的大豆转化系统。Gordon－Kamm等成功地将抗除草剂基因导入玉米胚性悬浮细胞和胚性愈伤组织。经基因枪处理的细胞先放到不含除草剂的培养基中培养一段时间，再放到含适量除草剂的培养基中进行筛选培养，最终获得转基因植株。经分子杂交检测证明，抗除草剂基因已整合到玉米的基因组中，并已遗传到R1代。许多实验室应用这一转化系统，将外源基因导入棉花、大麦等作物细胞。由于应用基因枪转基因技术在一些重要农作物的遗传转化上获得成功，引起生物学家、生物物理学家的普遍重视，近年来使这一技术不断完善和发展。首先对基因枪本身做了许多技术上的改进。在火药爆发气体加速的基础上，又发展了其它加速系统。如电子发射技术，是利用电子控制水滴或突然释放压缩气体或氦气产生冲击波，对微粒子进行加速。Sautter等设计一种气体脉冲装置直接加速DNA悬浮物，而不用微粒子载体。应用这种装置可以击中很小的组织面积，如小麦幼胚盾片，结果3%的细胞在1mm2的范围内获得报告基因的表达。PDS－1000／He(Bio-Rad实验室)是近来发展的一种系统，它利用突然释放氦气压缩气体产生冲击波加速一个小薄塑料片进入金属滤网，而载有外源基因的微粒子用乙醇悬浮在小塑料片表面。Sanford等应用这一装置对一些细胞和组织进行基因导入。通过实验，他们发现，与火药喷射气体加速装置相比，应用PDS－1000／He能提高微粒子的分散程度，减少受体细胞的损伤，从而提高基因转化频率。此外，他们又推出新型的PDS－1000／He，这种装置不必将组织置于真空中，并能用手控制。通过变换不同长度和大小的喷嘴通向不同的器官。由于可用手控制喷嘴接近受体组织，缩短微粒子的射程和减轻微粒子之间的摩擦，从而减少软组织的创伤，因此已用于活体动物及组织细胞的基因导入。中国科学院生物物理所姚山麟设计的JO－700型基因枪，采用密封样品室，减少对受体组织的污染，是目前世界上唯一的不必放在超净台内工作的基因枪。中国科学院微生物所燕义唐等用该基因枪将RSV外壳蛋白基因导入水稻悬浮细胞系，在含抗生素G418的培养基上筛选培养两个月后，获得大量绿苗。经ELISA分析及Southern检测证明，RSV外壳蛋白基因已整合入水稻基因组。1990年以来，中国农业科学院生物中心细胞室陈乐玫用JO－700型基因枪已将PBI121质粒导入小麦悬浮细胞，及小麦幼胚，并获得短暂表达。基因枪转化的小麦悬浮细胞及幼胚在含适量G418抗生素的培养基中进行筛选培养两个月，在诱导出的愈伤组织细胞及分化再生植株的叶片中，仍能检测到很强的报告基因表达。在此研究基础上，将愈伤组织进一步选择培养，最终获可育的小麦转基因植株。Southern检测证明，GVS基因已整合到小麦基因组中。R1代G!8抗性测试表明NPT Ⅱ基因的传递符合孟德尔单基因显性遗传规律。Paul christou等通过电子发射技术加速载有DNA的微粒进入水稻幼胚，获得水稻转基因植株，经分子杂交检测当代的及R1的植株，证明外源基因已整合到水稻基因组，并遗传给后代。在弄清基本原理的基础上，对影响转化频率的因素进行了研究。综合文献报道，影响转化频率的主要因素有(1)微粒子的冲量；(2)外源DNA量；(3)受体细胞单位面积所导入的微粒子量；(4)受体细胞的生理状态。而各因素都是受仪器不同条件控制。如微粒子的冲量与加速微粒子冲击波与微粒子形状、大小、样品室的真空度及微粒子的射程有关。对他们之间的关系进一步研究的结果表明，在高真空条件下，微粒子通过较长的射程可保持高速。因此说明，样品室的真空度、射程长短及样品所处的位置是基因枪的重要参数，可直接影响基因的转化频率。随着不同类型基因枪的推出，基因枪转基因技术应用的范围越来越广。文献报道，应用基因枪技术已扩展到可以将外源基因导入高等植物的组织器官、微生物及活体动物。由于线粒体和叶绿体很难进行基因转化，因此对其研究受到阻碍。而应用基因枪可将外源基因导入线粒体和叶绿体，从而为深入这方面的研究提供手段。应用基因枪转基因技术已将外源基因导入真菌和细菌细胞，如将外源基因导入使水稻胚细胞致病的真菌。以往对一些重要微生物的研究，由于很难被转化而受到限制。基因枪转基因对这一领域的研究提供了有效的方法。基因枪在活体动物、动物细胞和器官、昆虫遗传转化方面的应用进展很快。据报道，用基因枪已将报告基因导入活体动物的皮肤、肝脏及肌肉组织，并获得表达。另外，应用基因枪还将外源基因导入鱼卵、果蝇幼虫。基因枪处理的鱼卵，70%存活并孵出幼虫，5%的幼虫检测到β－gal基因的表达。报告基因导入果蝇幼虫并获得高频率表达。基因枪转基因技术已成功地应用于许多物种及不同的组织、细胞、器官的基因转化。没有基因枪转基因技术的发展，许多重要作物的基因工程育苗的成功，如玉米转基因植株的获得是不可能的。大量成功的例子证明，这一技术对动物的、植物的基因工程发展起了推动作用，特别是这一技术的应用已扩展到活体动物、器官、昆虫、鱼卵和幼虫的基因转化，预示着基因枪转基因技术在基因治疗、遗传免疫等研究领域也有广阔的应用前景。【参考文献】：1 Klein T M,et al. High-relocity microprojectiles for delivery of nucleicacids into living cells, 19872 Sanford J C,et al. J Part Sci Techorol,1987,5:27～373 McCabe DE.et al. Bio/Technology,1988,6:923-9264 Klein TM.et al. Bio/Technology, 1988,6:559-5635 Baldarelli R M.et al. NucAeid Res,1990,18:5903-59046 McCown BH,et al. Plant Cell Reports,1991,9:590-5947 Vasil V,et al. Bio/Technology, 1991,9:743-7478 燕义唐，等．表达水稻条纹病毒(RSV)外壳蛋白基因的转基因水稻植株全国植物分子生物学学术讨论会论文摘要汇编，1991，11(杭州)(中国农业科学院生物技术研究中心陈乐玫副研究员撰；姚山麟审) |
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