| 单词 | 分子生物学在土壤微生物领域的应用 |
| 释义 | 【分子生物学在土壤微生物领域的应用】 拼译：application of molecular-biology in soil microbes 土壤微生物最重要的作用是它们的生物地球化学活性。目前人们关注的是将原位土壤做为一个实体来研究土壤微生物生命活动的动态。显然，这类研究是和新技术的发展和应用分不开的。分子生物学在理论上和手段上的突飞猛进，推动着土壤微生物研究进一步深入。 自1877年Schlocsing发现土壤硝化作用开始，l891年Winogradsky发表硝化微生物研究报告以来，百年的土壤微生物学发展史的研究任务主要是根据农业生产的实际要求提出的。1945年，William Astbury首次使用分子生物学这个名词。1953年，Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型的提出，开创了分子生物学的新纪元。分子生物学已成为生命科学里的一个带头学科，成为向生命世界争取自由的有力的武器。土壤微生物领域最具影响的课题无疑是分子生物学在土壤微生物领域的应用，主要有以下3个方面：(1)从土壤微生物中分离基因重新组合，然后将基因重组菌返回土壤以用于促进作物生长(如固N等)、控制害虫或降解污染物等不同的目的。(2)基因探测法及PCR在土壤微生物中的应用。(3)rRNA顺序分析(主要是16SrRNA顺序分析)在土壤微生物分类、进化研究中的应用。遗传工程菌——genetically engineered microorganism(简称GEM)在土壤微生物领域的应用 GEM的应用前景十分广阔。例如苏云金芽胞杆菌产生的δ－内毒素蛋白，可用以防治鳞翅目昆虫，这种内毒素已商品化，用于生物防治已达20多年，但这种内毒素蛋白在使用时易被光解(日光分解)以及被土壤微生物分解。目前已将编码δ－内毒素蛋白的基因从苏云金杆菌的一个亚种Kurstati体内分出，转移到萤光假单胞菌体内。这种假单胞菌生活于玉米根际，用这种基因重组菌处理玉米种子，由于tox基因表达，这种假单胞菌亦能产生δ－内毒素蛋白，并可直接作用于玉米植物，避免光解，因而可更有效地防治虫害。但目前使用遗传工程菌首先要考虑安全问题(对人、动物、植物，对土著土壤微生物区系在生态系统功能中所起的物质分解、能量流动的可能影响)。其次，重组基因在土壤环境中的稳定性如何、遗传工程菌的生存能力以及所携带的质粒或基因是否会扩散给土著微生物等等，都是目前土壤微生物研究人员所关注的。尤其是安全问题，实际上是关系到遗传工程菌能否实际应用。美国环保局EPA对此有严格规定，不单是土壤微生物领域的基因重组菌，所有的遗传工程菌在土壤中的行为必须在有安全保证的前提下才允许使用，因为谁也不能保证这些菌如用于工业等不同的目的时不会“泄漏”到环境中，而“泄漏”到环境中最后不是集中于地表水、地面水就是集中于土壤或底泥。实际上已有基因重组菌对土著微生物区系影响的报道。目前，这类研究相当多，但总的说来一般认为还是安全的。由于将遗传工程菌引入环境后存在重组基因是否稳定，引入的菌能否在土壤环境中生存，如能生存其生存能力又如何，其所携带的基因是否会扩散给土著微生物等等，因而引起很多关于质粒和重组基因以及遗传菌本身在土壤中的迁移、稳定、遗传工程菌在土壤中生存能力的研究。由于研究遗传工程菌引入环境后的安全及其生存能力、基因的稳定、扩散等问题的需要，导致了基因探测法与PCR技术引入土壤微生物。基因探测法就是利用DNA碱基互补的特性，用限制性内切酶在不同的位点将目标菌的DNA或RNA切割成一个个大小不等的小片段，由于限制性内切酶对碱基识别的特异性，故切割位点也是特定的。然后用已知的DNA或RNA小片段(称为探针)与这些切割开的小片段混合，由于DNA或RNA碱基互补的特性，结构，相同的或类似的片段即与探针DNA杂交。目标菌的DNA与探针DNA是否有杂交和杂交多少可由以32P、35S等等标定的Probe DNA(RNA)的放射强度测出，也可由萤光分析测出，即探针DNA由溴化乙锭染色，而EtBr在紫外光照射下呈萤光；或根据颜色反应测定，即先将生物素与probe DNA结合、然后以抗生物素蛋白(avidin)以及相应的酶与之起颜色反应；也有用蛋白作连结将同位素标定的抗体与生物素结合的方法的。测定方法较多，各有优缺点，但用得较多的为同位素标定及EtBr方法。至于目标菌与Probe DNA杂交，常用的方法为先将DNA从细胞中取出(用酶解或反复的速冻－升温方法)以氯化锶梯度离心，加入EtBr，由于EtBr与DNA的亲和性，DNA形成的带可在紫外光下呈萤光。DNA经分离提纯、失活、酶解等处理，然置于支持物(醋酸纤维膜等)进行杂交。一般多将DNA小片段电泳分开，然后杂交的以放射自显影显示出来。此外，亦有先使目标菌在培养皿内长成菌后，用酶直接裂解细胞，然后放一滤膜将释出的DNA吸附进行杂交，即可知目标菌所在的菌落。除上述的各种方法外，还有将探针DNA与rRNA杂交然后用磁力法将未杂交的DNA与rRNA分开的等等。由于用基因探测法检测的实际上是同源DNA或RNA片段，直接检测目标微生物的DNA或RNA与已知微生物的特征DNA或RNA(即用来做probe的特征DNA小片段)的相似性，因为这是在分子水平上的检测，所以具有极高的准确性。近年来，基因探测法已逐渐应用到土壤微生物领域，随着GEM的应用而出现的安全性等问题都涉及到更有效地控制、监测土壤微生物的手段、方法。常规的培养基、常规的分离方法都有其局限性，不仅费时费事，灵敏度不高，且有的微生物在培养基中转接几代后会改变生理特性，还有的微生物是无法培养的。萤光抗体法，尤其是单克隆抗体法灵敏度高，可以识别单个细胞，但如识别一个微生物种则往往要一组不同的单克隆抗体，而且重复性也有问题。基因探测法的最大优点是：(1)不需培养微生物即可检测到(死的、活的均可测)；(2)可从混合种群中检测特定微生物；(3)可测得自然界微生物群体中涉及到基因的改变与在群体中的转移。但目前的基因探测法也有一定的局限性，即一般要有一定的DNA量方可产生足够的检测信号(放射性、萤光等)，而多聚酶链反应(PCR)可克服这一缺陷。1985年，美国马利斯(K．B．Mullis)等创立PCR技术。它可以从极微量的生物材料中简便快速地得到大量特定的基因，或在众多复杂的生物基因中检测出单拷贝基因。其方法是将目标DNA链以限制性内切酶在特定的位点切割，在95℃的温度下失活解链，然后降温在引物的引发下以目标DNA的单链为模板，以添加λ的核苷酸为原料合成目标DNA，按(95℃模板变性→45～55℃引物复性→65～75℃DNA合成的顺序经20～30个循环，即将原来的少量目标DNA复制百万倍以上。因此，PCR的反应过程实际上是一个目标DNA的放大过程，即使原来只有一个目标DNA，系PCR放大后也足以用基因探针测出。PCR法现已推广应用到检测水体微生物及土壤微生物，但只是刚刚起步，实际应用中有时会碰到诸如土壤中释出的一些未知因素(如有机物或重金属等)对限制性内切酶活性的干扰等问题。随着PCR法在土壤微生物领域中的推广应用，这些暂时存在的技术问题正不断解决。rRNA顺序分析(主要是16SrRNA顺序分析)在土壤微生物分类、进化研究中的应用 rRNA顺序分析的原理，是利用rRNA顺序(尤其是某些特征顺序或称信号顺序)的相似性确定微生物的亲缘、进化关系。因为rRNA在进化上较为古老且功能稳定，进化中较保守，并且容易从细胞中分离提纯。在3种rRNA(5S、16S、23S)中，5SrRNA分子太小(约120核苷酸)，信息太少，故一般不用；16S(约1500核苷酸)、23S(约3000核苷酸)含有一些高度保守的顺序区间，故可用于分类及确定微生物的进化关系；其中16S比23S用得多，因实验好做，其中某些rRNA顺序的高度保守区间更是用作鉴定、检测微生物的根据，在gene probe中大量使用。目前，16SrRNA顺序分析已广泛用于微生物分类与进化研究。由于16SrRNA顺序分析法的兴起，对微生物的进化认识已开始深入到分子水平，许多微生物的分类及进化地位已被重新改写。例如主要由于其特有的16SrRNA核苷酸顺序，并结合其与其他细菌不同的细胞壁结构(无肽聚糖，而是由N－Z酰葡萄糖胺和N－Z酰塔罗糖以β－1．3糖苷链相连，短肽由L型氨基酸交链的假肽聚糖)、细胞膜脂质联结为醚相联结而不是酯键相联等等，已将甲烷细菌、极端嗜盐细菌、极端嗜酸细菌及极端嗜热细菌单独分出为古细菌，与真细菌并列，共同组成原核微生物。16SrRNA顺序分析在分类与进化研究上的重要性，对土壤微生物学的影响由此可以想见。【参考文献】：1 Obukowicz M G, et al. Journal of Bacteriology. 1986,982～ 9892 Holben W E, et al. Appl Environ. Microbiol. 1988,703 ～ 7113 Compeau G, et al. Appl Environ. Microbiol. 1988,2432～ 24384 Holben W E. Ecology, 1988,69(3) : 561 ～5685 Bej A K, et al. Appl Environ Microiol. 1990,307～3146 Van Elasas J D, et al. FEMS Micobiol Ecol. 1990,73:1～127 Short K A,et al. Appl Environ Microbiol. 1991, 57s 412～ 4188 Klingmuller W. FEMS Microbiol Ecol 1991,107～1169 Selenska S, et al. FEMS Microbiolgy letters. 1991,80:243 ～24610 Pipke R, et al. App Environ Microbiol. 1992,1258-1265(南京大学叶定一博士、曹幼琴副教授撰；朱洪文审) |
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