| 单词 | 克隆DNA的体外定位诱变 |
| 释义 | 【克隆DNA的体外定位诱变】 拼译：site-specific mutagenesis； of cloned DNA in vitro 基因或其他遗传单位中DNA序列的细微改变往往影响到基因的功能。经典遗传学研究通常是依靠生物性状的改变筛选突变型，然后经过基因克隆和测序，找出突变型和野生型在DNA序列上的差别，这种方法现在虽然仍在使用，但缺点是很显然的：(1)经典诱变方法能够产生的突变种类十分有限；(2)诱变处理是用整个生物体，要得到所需的突变，几率是很低的；(3)通常靠表型鉴别突变型，那些在表型上难以和野生型区别的基因就无法筛选出来。由于重组DNA技术的发展，现在可以采用和经典遗传诱变法相反的程序，即采用各种化学方法或酶学方法对克隆的DNA片段进行诱变处理，然后分析突变型遗传结构和功能的关系。这样的诱变效率极高，位置不限，而且无需考虑到它的表型变化。 20世纪70年代末期，寡核苷酸人工合成的常规技术取得很大进展，各种DNA聚合酶和连接酶的质量也得到改进。这些都为寡核苷酸引导的定位诱变技术的发展提供了必要的条件。寡核苷酸引导的定位诱变就是利用人工合成的寡核苷酸为诱变引物，按照设计好的方案在已知的DNA序列中准确地改变蛋白质氨基酸编码中一个或几个碱基，以研究蛋白质结构与功能的关系。同样，定位诱变还用于研究基因调节中转录、转译和DNA加工等和核苷酸序列改变的关系，准确找出基因调控的关键部位，以及构建新的克隆载体和嵌合基因，如把启动基因，核糖体结合位点或多腺苷酸等信号加到表达质粒的指定位置，除去不合适的酶切位点，加上适合的酶切位点等。此外，还能除去DNA片段中不需要的序列(如内含子)以及对蛋白质基因的不同结构域进行精确地拼接和融合等等。寡核苷酸引导的定位诱变要求：(1)待诱变的DNA片段克隆到能自主复制的载体上并已测序；(2)以重组单链DNA为模板，如常用的大肠杆菌M13单链DNA噬菌体等；(3)人工合成的寡核苷酸为诱变引物；(4)非诱变部分的DNA序列能忠实地复制。近年来，随着M13类载体在DNA测序中广泛应用和核苷酸自动合成仪逐渐普及，以及高质量的DNA聚合酶、连接酶的生产等，上述条件在国内一般分子生物学研究单位已不难办到。定位诱变的基本方法是通过一个诱变引物构成单点诱变、多点诱变、插入诱变和缺失诱变等。诱变的步骤一般包括：(1)把待诱变的DNA克隆到M13噬菌体载体上，并由重组M13噬菌体制备重组M13单链DNA模板；(2)设计并合成寡核苷酸诱变引物；(3)把诱变引物结合到重组单链DNA模板上；(4)借助于DNA聚合酶、T4DNA连接酶和4种dNTPs使诱变引物沿着模板延伸并连接成异源双链DNA，新合成链中含有诱变点：(5)异源双链DNA转化大肠杆菌，分离出野生型的和突变型子代；(6)筛选突变型子代；(7)用核苷酸测序法证实突变型子代中含有所需的突变点；(8)回收突变的DNA片段，并用突变的DNA片段置换野生型DNA的相应片段。以上由寡核苷酸引导的体外定位诱变技术，原则上是普遍适用的，但一般诱变的效率比较低，主要原因是：(1)在引物延伸连接反应混合物中，除了异源双链DNA外，还杂有相当多未结合引物的ss－DNA模板和引物延伸不完全的部分双链DNA分子，这两类分子转化后都形成野生型子代。(2)在大肠杆菌中存在甲基定向的错配DNA修复系统，主要修复非甲基化的DNA。在细胞中新合成的DNA链尚未被甲基化，其中错配的位置就会优先被修复，从而防止突变的发生。同样，定位诱变中在体外合成的突变DNA链也是未甲基化的，转化到细胞后也会被修复，因此在转化子代中主要是野生型的。(3)有些质量不高的DNA聚合酶Klenow片段仍然残存一些5’－3’外切酶活性。在新链延伸过程中，引物容易受到5’－3’外切酶的消化，如果降解越过引物上的诱变点，新合成的链将是野生型的。为了提高诱变效率，可以用蔗糖梯度离心法或凝胶电泳法分离异源双链DNA，或用硝酸纤维素滤膜分离除掉ss－DNA和选用mutL．mutS或mutH突变的大肠杆菌为转化宿主，阻止错配DNA的修复，增大突变型的比例；以及用双引物法(Zoller & Smith，1987)保护诱变引物不被5’－3’外切酶降解等等。这些改进措施虽然可以把诱变效率提高一些，但突变型子代的筛选仍较困难。通常需要用杂交法，以诱变引物为探针，从众多子代噬菌斑中筛选出突变型子代，但这毕竟是一项费时费事的步骤。80年代中期，随着定位诱变法在分子生物学研究中的应用，研究工作者又设计出一些阻止野生型子代生长，提高诱变效率的方法，如缺口双链DNA法(Kramer等，1984)、EcoK／EcoB循环选择诱变法(Carter等，1985)、脱氧硫代核苷酸保护法(Nakamaye & Eckstein，1986)以及含尿嘧啶单链DNA模板法(Kunkel等，1987)等。这些方法的诱变效率都能达到50%以上，由于诱变的效率高，只需分离少数噬菌斑就能得到所需的突变型，大大简化了筛选突变型的手续。含尿嘧啶单链DNA模板法是其中较为简便、适用范围较广的一种方法。所谓含尿嘧啶单链DNA模板，就是在DNA模板中的少数胸腺嘧啶残基(T)为尿嘧啶(U)所取代。在大肠杆菌dutung－菌株中可以制备这种模板。在dut－突变型中没有脱氧尿苷酸酶，细胞内的dUTP浓度高，可以和dTTP竞争并参入到DNA中；ung－突变型缺少尿嘧啶－N－糖基化酶，这种酶的作用是降解DNA中的尿嘧啶。因此，在dut－ung－突变型中dUTP可以取代dTTP参入DNA的一些部位，并且不被清除掉，任何常用的M13类载体都可以在dut－ung－宿主中培养制备含尿嘧啶的DNA模板。这种模板中通常每个基因组含20～30个尿嘧啶残基。在实验条件下含尿嘧啶的ss－DNA模板和正常模板没有区别，模板中dUMP和dTMP的编码相同，不会造成诱变。模板中的尿嘧啶也不会妨碍DNA的体外合成。当诱变引物沿着含尿嘧啶ss－DNA模板合成新链时，底物中只加4种dNTPs，不含尿嘧啶。新合成的异源RF DNA转染野生型(dut+ung+)大肠杆菌后，含尿嘧啶的模板链被细胞内的尿嘧啶N－糖基化酶降解。由于模板链没有生物活性，转染子主要来自诱变的互补链。单点诱变效率可达50%～80%。此法除了需要一株(dut+ung+)菌株制备含尿嘧啶模板外，别无其他要求。聚合酶链反应(PCR)是80年代后期兴起的一项在体外大量扩增DNA片段的新技术，由于其方法简单快速，近年来发展极快。PCR技术略加改动也适用于DNA片段的定位诱变(Higuchi等，1988)。PCR定位诱变法对DNA模板无特殊要求，无论单链DNA或双链DNA均可使用，也可以用环状DNA，如重组质粒DNA为模板(Hemslcy等，1989；Jones & Howard，1990)。由于PCR的引物是设在模板的两端，若要把诱变点安排到DNA片段的任何部位，必须对PCR扩增技术进行一些调整，增加引物个数和PCR扩增反应次数，手续较为繁杂。此外，Taq DNA聚合酶中没有校正读码的3’－5’外切酶活性，扩增的DNA片段愈长，差错出现的几率也愈高，这些都是有待克服的。80年代中期以来，飞速发展的定位诱变技术在分子生物学领域和蛋白质工程研究中起了很大地推动作用。近年来兴起的蛋白质工程中把这种方法称作“反向遗传学”，它是目前分析蛋白质结构与功能关系的最有力的手段之一。随着这项技术的广泛应用，定位诱变方法也必将得到进一步的简化和完善。【参考文献】：1 Kramer W,et al. NucI Acids Res, 1984 ,12:94412 Carter P,et al. NucI Acids Res,1985.13:44313 Nakamaye K L,Eckstein F. Nucl Acids Res,1986,14:96794 Zoller M J &. Smith M. Methods Enzymol, 1987,154:3675 Kunkel T A,et al. Methods Enzymol, 1987,154:3676 Higuchi R,et al. Nuc! Acids Res,1988,16:73517 Hemsley A,et al. Nucl Acids Res, 1989,17 ,65458 Jones D H，Howard B H．BioTechniques，1990，8∶1789 陈乃用，微生物学通报，1991．18(1)∶27(中国科学院微生物研究所陈乃用研究员撰) |
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