“交联法在分子生物学研究中的应用”的概念、定义、翻译、参考文献-科学参考

单词

交联法在分子生物学研究中的应用

释义

【交联法在分子生物学研究中的应用】

拼译：application of crosslink method in molecular biology studies

随着分子生物学研究的不断深入，人们逐渐认识到大部分重要生命活动并不是归结于单一生物大分子的功能，而是依赖于两种或两种以上生物大分子的严格时空控制的相互作用。生物大分子的相互作用在分子生物学研究中占居愈来愈重要的位置。过去，X线衍射、圆二色光谱、电镜等物理方法在阐明生物大分子相互作用的工作中作出了很重要贡献。但由于这些方法只限于体外观察，要求复杂、冗长的分离纯化过程，许多结果很难说代表生命活动的真实情况。有些对象(如某些生物大分子复合物实体中心的分子相互作用或瞬间存在的结构等)更是上述方法难以检测的。交联法可通过固定活体内的分子间相互关系，然后进行离体操作分析。在一般情况下，离体的实验条件和过程不会破坏这种被交联固定的空间关系。因而结果的真实性、准确性和以往方法相比，无疑有所改善，所测相互作用距离也短得多，更为可取的是在有些方法失效的情况下也可使用。

交联是一种共价结合，它既可出现在生物大分子间，也可产生于分子内。交联法利用生物大分子在一定条件下某个(些)功能团能发生化学反应、形成共价结合这一性质，以连接空间上毗邻的两个大分子或同一分子的两不同组分、从而固定体内、分子间的空间排列关系或其瞬间相互作用方式。形成交联的方法有物理法(主要是UV照射)和化学法(双功能试剂处理和核苷酸活泼类似物掺入)。其原理均是通过交联因素活化相邻的两功能基团以发生化学反应而形成共价结合。自70年代末期以来，交联法在遗传物质的高级结构、DNA构象、RNA立体结构、基因表达的调控、蛋白质合成等研究中应用。取得以下进展。

1．在研究DNA－蛋白质复合体中的应用。1985年，Solomon等利用甲醛介导的DNA－蛋白质交联研究了体内外SV40的染色质结构，并通过比较体外lac阻遏蛋白与lac启动子、a蛋白与相应的DNA、血清白蛋白与普通DNA3种复合物的实验结果，证明甲醛介导的DNA－蛋白质交联可作为立体结构探针用于染色体结构的研究，衡量染色质区域的基因活性状态的指标。1979年Lohr等所做的交联实验表明，染色质的核小体排列与基因活性的调控是由于组蛋白八聚体对DNA顺序的选择性或者说是因DNA上核小体排列的周期所致，核小体排列方式的不同主要在于核小体核心颗粒以外间隔区的长短不同。交联后结果分析，得出了组蛋白八聚体中各组分的空间排列、各组蛋白单体与DNA的空间排列、H₁和八聚体与DNA的空间排列(Karpov，1982)。

将腺病毒粒子用³²P－磷酸和³H－精氨酸同时或分别标记，随即以UV照射，使空间相邻的核苷酸、氨基酸形成交联，发现蛋白VⅡ、V在核心内与病毒DNA紧密接触，推测出病毒DNA的装配机制(Chatterjee，1977)。通过组蛋白与DNA的交联发现，随着热激蛋白70基因的转录增加，编码区域的H₁首先消失，随后所有的组蛋白都消失。在DNaseI敏感区域的5’末端未发现任何组蛋白，并证明这为基因激活所必需。交联实验确定：在lacUV5启动子与细菌RNA多聚酶的作用部位中，α亚基不与DNA结合，而β、β’和σ亚基与从+30到－47核苷酸之间的启动子相互作用，说明启动子的这一段与转录的启动有关。此外，交联的研究结果表明，无论是组蛋白、还是RNA聚合酶都是通过赖氨酸盐桥与DNA以离子键结合。

2．在研究RNA－蛋白质复合体中的应用。用异双功能剂(有两个不同的功能基团)处理BMV粒子，使其中的蛋白质与RNA交联，表明，BMV外壳蛋白的188个氨基酸中只有N末端的80个氨基酸残基与RNA交联。提示两个α螺旋(11～19，20～80)在外壳蛋白－病毒RNA的相互作用中十分重要。利用UV照射分离的肝细胞和脾结节淋巴细胞的胞核，发现Poly(A)⁺hnRNA与一种磷酸化蛋白交联。这种蛋白的分子量为110000。如果用低浓度α－鹅膏蕈碱抑制合成hnRNA的聚合酶，这种交联蛋白的相对量也降低。这两方面均说明此蛋白与hnRNA紧密相关。

真核生物mRNA5’端的帽子结构除使mRNA5’端免受外切酶降解外，还参与premRNA的加工。但哪些蛋白或多肽因子参与对帽子结构的识别，一直不清。只有当1977年Sonenberg等通过将帽子结构已氧化的mRNA与结合于帽子结构中(或附近)的多肽共价交联，首先确定：在兔网织红细胞核小体的高盐洗脱液中，一种24000的多肽与帽子结构交联。另外，28000、50000、80000多肽也能以依赖ATP－Mg²⁺的方式与氧化的帽子结构交联。Lee等和Edery等在此基础上用交联法进一步研究，提出了帽子识别因子促进mRNA－核糖体相互作用的模型，并为Pelletier等的交联实验研究所证实。通过250nmUV照射eIF－mRNA非共价复合物，使两者交联。RNase消化后的电泳实验表明，eIF－4A，4B，4C以及eIF－3亚基都能与SFV mRNA交联，而不能与rRNA交联。说明eIF先与mRNA结合形成复合物然后与核糖体结合再完成起始过程。1985年，Tukalo等以铂化合物作为交联剂研究了tRNA与氨酰基－tRNA合成酶的相互作用，阐明了合成酶对tRNA、氨酰基的各自识别部位，初步解释了为何能通过此类合成酶准确地将记载在核酸序列上的遗传密码转变为蛋白质序列的信息。

为确定肽酰－tRNA与核糖体结合位点的核糖体组分，1982年Riehl等用化学法将tRNAphe分子中的胞嘧啶转化为4－硫尿嘧啶(S4U)。修饰后的核苷在335nm光照下能与邻近的亲核基团形成交联。研究表明硫化的苯丙氨酰－tRNAphe在Poly(U)存在的情况下与核糖体P位点结合。直接照射(S4U)RNA^phe／Poly(U)／70S核糖体复合物，发现交联仅在30S亚基中出现。产物分析表明苯丙氨酰－(S4U)tRNA^phe特异结合于S10核糖体蛋白质。用UV照射大鼠60S亚基，发现UV导致5SRNA－蛋白质交联。通过¹²⁵I标记蛋白质、RNase消化和双向电泳，证明与5SRNA交联的蛋白是L5。这说明它们在空间上紧密相邻。

3．在研究DNA、RNA空间结构和不同RNA间相互作用中的应用。将能形成Z型的DNA序列(CT)₂₁，(GT)₁₂ATGT，(CG)₆TA(CG)₆克隆，以交联剂TMP处理这些质粒。发现：如果这些序列以B型(松驰状态)存在，TMP则可在其中形成较多交联；如果超螺旋DNA以Z型存在，交联数目则大大减少。这些序列的交联数目与DNA的超螺旋度相关。因此可用交联数量反过来检测Z－DNA的左螺旋度。这会使体内外的DNA构象测定大大简化。以TMP介导，用长波长UV照射E．coli16SrRNA，在空间相邻部位引入交联，然后用RNaseT1部分酶解，分离交联片段，去除交联，进行序列分析即可定出交联部位。此法的交联定位准确度达±15核苷酸。严格控制TMP的反应，可获得更准确定位。根据交联部位和其已知的1级、2级结构，即可获得RNA分子的准确空间结构。1984年Steiner等发现，酵母tRNA^phe中靠近反密码子3’端的核苷酸在与E．coli核糖体结合时能与mRNA交联。tRNA交联于对应密码5’位置上。说明密码子的第1个碱基配对在识别mRNA上的密码时至关重要。1985年，Rinke等借助TMP交联研究了U₄与U₆碱基配对情况(snRNA正是利用与hnRNA的碱基配对行使其功能)。得知U4的两个重叠片段(52～65)与U₆的一个片段(51～59)交联。大部分hnRNAP或premRNA含有SnRNA的互补序列。剪切过程中，预期会形成不稳定的snRNA－hnRNA杂交产物，但一直未能找到。1982年Pogo等在TMP存在下用252nmUV照射去除了DNA的核，终于找到了snRNA－hnRNA的交联产物，并证明在所有交联的snRNA中，U1占多数。

在蛋白质合成时，tRNA是与核糖体的蛋白作用，还是与rRNA结合，一直不清。Chen等将E．coli tRNA^Gly20位的双氢尿嘧啶残基用光敏剂取代。光致敏交联后的分析表明，tRNA^GLy与之核糖体中的Poly(GU)片段交联，三分之二的tRNA与30S亚基的16SrRNA结合，且结合于rRNA的5’和3’两端。此外，发现少量的N－乙酰基丙氨酰基－tRNA^Gly交联于50S亚基上的rRNA，而不是在对嘌呤霉素敏感的区域。

近年来，交联法一方面已成为分子生物学的常规技术，一方面随着分化相关基因、癌基因、抑癌基因、细胞活性因子基因克隆与表达调控在分子生物学研究中所占比例愈来愈大，交联法的主要应用亦逐渐集中于这些基因的结构、调控研究，此外，利用¹²⁵I标记的配基与其受体的交联、筛选各种配基对应受体的cDNA已逐渐发展成为最直接、有效的受体克隆途径，交联法的应用范围亦已由经典的核酸一蛋白质，核酸一核酸相互作用拓展到更为广泛的蛋白质－蛋白质相互作用。

【参考文献】：

1 Lohr D,et al. Proc Natl Acad Sci. USA.1979,76:6326

2 Karpov V L,et al. Nucleic Acids Res.1982,10:4321

3 Pogo A S,et al. The Nuclear Envelope and the Nuclear Ma-trix,Alan R Liss Inc Ny.1982.233

4 Richl N.et al. Eur J Biochem,1982.128:427

5 Steiner G,et al. Nucleic Acids Res,1984,12:81821

6 Tukalo M A.et al. Dokl Akad Nauk SSSR,1985,280:1484

7 Solomon M T,et al. Proc Natl Acad Sei. USA, 1985. 82; 6470

8 Rink J,et al. J Mol Biol, 1985,185:721

9 Chatteriee P K,et al. J Mol Biol, 1986 ,188:23

10 Park L S,et al. Proc Natl Acad Sci. USA,1992,89:4295

(北京放射医学研究所贺福初研究员撰；夏寿萱审)

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