| 单词 | 苹果原生质体培养 |
| 释义 | 【苹果原生质体培养】 拼译：apple protoplasts culture 苹果为多年生木本植物，苹果为高度杂合体，杂交后广泛分离，较难选出具有优良性状的新品种，而且用有性杂交方法培育出新品种需较长时间及大量人力物力。苹果原生质体培养的再生植株中，将会有很多变异，其中包括染色体数目、结构及核苷酸序列的改变，也包括抗病性、抗寒性、果实颜色、品质等重要农艺性状的改变，可利用苹果原生质体培养在现有品种中直接筛选变异。苹果原生质体再生系统的建立，可为细胞融合及遗传转化得到的杂种细胞及转化细胞的再生提供技术方法。 1983年，哈昂(S．C．Huang)等首次从苹果叶组织分离出原生质体。同年，尼泽基(M．Niizeki)等首次将苹果原生质体培养成愈伤组织。1984年，科威德(M．Kouider)等从红玉苹果叶愈伤组织和细胞悬浮培养物中分离出原生质体并培养成愈伤组织，此愈伤组织在附加吲哚乙酸和6－苄基嘌呤的培养基上形成胚状结构，这些结构仅形成根而没有发育成完整植株。1988年，奥查特(E．M．Patat－Ochatt)等首次将苹果砧木Mq、MM106及品种斯巴坦的原生质体再生植株。1992年，丁爱萍等从新红星苹果胚珠愈伤组织建立的胚性悬浮细胞系分离原生质体并获得再生新梢。苹果原生质体的培养，均采用混合酶一步法分离原生质体。混合酶通常含有1%～2%纤维素酶“Onozuka R－10”和0．1%～0．5%果胶酶Y－23。分离得到高产量、高活性的原生质体，是苹果原生质体培养的一个首要条件。许多因素影响原生质体的产量和活性，如材料来源、酶的组合、渗透剂及质膜稳定剂的选用等。1984年，科威德等认为分离原生质体最好的材料是幼嫩、快速生长的悬浮培养物。1985年，沃林(A．Wallin)等使用向培养基中添加L－蛋氨酸的方法，可显著提高离体培养新梢的原生质体产量。1987年，里维拉(M．A．Revilla)等对多种落叶果树和坚果种叶肉原生质体分离进行研究，认为材料的生理状态是木本种类原生质体分离的决定性因子。采自快速生长植株上的刚刚伸展的叶子，在原生质体产量和活性上均得出最好的结果。这一点对温室中生长的植株更为明显。苹果、梨等枝培养结果相似，从最小的完全伸展的叶子中分离的原生质体产量和活性最高，老叶子及生长慢的叶子得到极少或得不到原生质体。1988年，道蒂(S．Doughty)等从绿袖苹果得到高产的(1．85×107／gFW)叶肉原生质体，认为叶需经严格筛选以避免组织变褐，否则会影响原生质体的产量和活性。去除表皮比直接切片好，前者高活性原生质体达到90%，后者为80%。生根枝上的叶通常产生高活性原生质体。叶先经CPW13M培养基质壁分离，再酶解，对原生质体产量和活性很重要。1990年，丁爱萍等对新红星苹果原生质体研究结果表明，培养7d的愈伤组织原生质体产量明显高于培养14d、21d、28d的，随继代培养时间的增加原生质体产量递减。在适宜条件下，材料来源及培养时间是影响原生质体产量和活性的主要因素。重复试验表明，经7次以上连续继代培养建立的悬浮细胞系，继代后5～7d的悬浮培养物是获得大量活性高的原生质体的好材料。原生质体纯化，一般采用沉降法、漂浮法或界面法。细胞壁的去除，可用荧光增白剂显微法确认。原生质体活性，可用荧光素双醋酸酯染色或酚藏花红染色测定。苹果原生质体培养方法有固体培养法、液体培养法和半固体培养法。影响因素有原生质体活性、接种密度、培养基组成、培养方法及培养条件等。1983年，尼泽基等用液体浅层法培养苹果原生质体，认为高密度原生质体如3～4×105／ml，导致细胞团形成频率低，最适密度为1～2×105／ml。1984年，赫威泽等用液体静置法以104／ml密度培养苹果原生质体，细胞分裂在4～8细胞期停止。1984年，科威德等的研究资料表明，红玉苹果原生质体在液体培养基中经5～10d形成细胞壁，在MS及B5培养基中经常出芽，仅有少量细胞分裂。在半固体KM8p培养基中经2～3d即可分裂。持续的生长只有将原生质体形成的细胞团从KM8p培养基中转移至饲养层或加0．4mg／L 2，4－D和20g／L葡萄糖的固体MS培养基上才能获得。饲养层方法对于红玉苹果形成细胞团是有效的。认为刺激细胞分裂的关键因子是逐渐降低渗透剂的水平。发现能使原生质体的加氧作用很好进行的植板方法对原生质体生长是一个重要因子，因为当原生质体植板于KM8p半固体培养基近表面时，细胞分裂较好。密度为5×107／L时，分裂频率可达20%以上。聚乙烯吡咯酮可减弱愈伤组织褐化。脱落酸可增加30%～50%胚样结构的形成。1988年道蒂等的研究资料表明，持续在光下培养的原生质体不形成细胞团。叶原生质体趋向聚集，然后分裂，植板率不能精确测定。半固体悬滴培养，不更换培养皿中的培养基，愈伤组织(＞1．5mm)形成频率为1．4／105，更换培养基频率升至6．5／105。这是因为更换培养基可能移走了影响细胞团形成的酚类物质。光照条件下愈伤组织形成绿色节带，进行组织学观察可见维管分化，但无分生组织活性区域。这种绿色节带的形成不一定在新梢产生之前，并预示苹果叶肉原生质体可能最后成为原生质体——植株系统的基础。1988年，奥查特等对苹果砧木M9、MM106及品种斯巴坦原生质体培养结果表明，不同基因型原生质体对基本培养基有选择性。形成愈伤组织后，砧木与品种的分化需要不同培养基。M9愈伤组织在分化培养基中表面出现光滑的瘤，10d后形成芽。再生能力可持续两个以上的连续继代培养。MM10610%愈伤组织形成新梢，但在M9所用的培养基上没有再生。一次继代后再生能力消失。与砧木相同，品种的不同基因型原生质体对培养所需营养也不同。认为加微量GA3可提高愈伤组织形成新梢的能力。暗培养对砧木及品种原生质体系统均显示最高的起始植板效应(15d)和最终植板效应(60d)。KM8及KM8P培养基有利于品种原生质体生长。除去或降低培养基中铵离子，对某些基因型原生质体生长有利。有机成分浓度对苹果砧木原生质体生长有重要影响。砧木与接穗均需较高植板密度，即5．0×108／L。一般来说，高生长素、低细胞分裂素有利于生长。对砧木来说以萘乙酸最好，对接穗2，4－D较好。B族维生素和酪蛋白水解物是必需的。砧木原生质体形成的愈伤组织分化出芽需间苯三酚。1992年，丁爱萍等由新红星胚珠愈伤组织建立的胚性悬浮细胞系分离原生质体，经培养获得再生新梢，认为用胚性悬浮细胞系游离原生质体是原生质体再生植株的关键。由原生质体分裂至细胞团形成、愈伤组织形成乃至愈伤组织分化的各阶段，根据生长情况及时更换培养基及调整渗透压，使其一直保持旺盛生长势，是原生质体再生的另一关键。到目前为止，还没有建立起重复性较好的快速苹果原生质体再生系统。苹果原生质体培养的研究重点仍是原生质体培养方法、培养基及附加成分的选择。研究的主要难题是原生质体形成愈伤组织后不易分化再生植株、特别是栽培品种原生质体较难再生植株。苹果原生质体作为受体的遗传转化将成为该领域今后10年内的研究热点，但这项研究尚存在许多难关，如对苹果某些重要农艺性状的遗传背景了解甚少；缺乏目的基因；需建立遗传转化系统。建立高效苹果原生质体再生系统，无论是细胞融合还是遗传转化，都依赖原生质体再生系统才能最终实现性状表达。原生质体再生植株性状分离资料的收集及其遗传规律的研究，将为种质资源的利用及基因工程研究提供理论依据。在苹果原生质体再生植株中进行选种；利用物理的或化学的方法诱导原生质体变异，培养变异的原生质体再生植株，选择具有优良性状组合的个体进行无性繁殖，直接应用于生产；苹果原生质体融合，在有性不亲和及花期不遇等种内及种间获得体细胞杂种植株等等课题，将有广阔的应用前景。随着生物工程技术的飞速发展，通过上述课题的研究，可望在本世纪末培育出多抗、优质、高产的苹果新品种。【参考文献】：1 Minoru Niizeki．Yutaka Hidano and Ken-ichi Saito．Japan：J．Breed．，1983，33(4)：369～3742 Charles D．Soc．Hor．Sci．1984，109：348～3503 Mohamed Kouider，et al．，Plant Cell Reports，1984，3：142～1494 Anita Wallin，Margareta Welander．Plant Cell Tissue Organ Culture，1985，5：69～725 Revilla M Aa，Ochatt S J，Doughty S，et al．Plant Science，1987，50：133～1376 Doughty S，Power J B．Plant Cell Reports，1988，7：200～2017 Patat-Ochatt E M，Ochatt S J，Power J B．J．Plant Physiol，1988，133：460～4658 丁爱萍，曹玉芬．园艺学报，1992，19(3)：267～2689 丁爱萍，曹玉芬．植物生理学通讯，1992，28(3)：206～207(中国农业科学院果树研究所丁爱萍撰；孙勇如审) |
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